通信作者：曹治興，博士，講師，主要從事腫瘤分子生物藥效學和毒理學。E-mail：284886361@qq.com

廣藿香油及其主要成分對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的比較研究

楊雨婷1，2何育霖1張雪1，2盧俊宇1李玉芝1何貝軒1彭成1，2曹治興1，2*

1.成都中醫(yī)藥大學，四川成都611137；2.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都610075

【摘要】目的：觀察和比較廣藿香油及其主要成分廣藿香醇、廣藿香酮對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性。方法：分別將發(fā)育10h的胚胎置于梯度濃度的廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮中培養(yǎng)，于24h、48h、72h、96h觀察和統(tǒng)計各組斑馬魚胚胎的死亡率、畸形率、胚胎形態(tài)、擺尾次數(shù)和心率。結果：隨作用時間延長，三種藥物毒性表現(xiàn)越明顯；24h時廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚的LD50分別為50.3、12.9mg/L，廣藿香油組無明顯致死現(xiàn)象； 96h時廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚胚胎的LC50分別為21.22、12.863、11.76mg/L。對比12mg/L濃度下三種藥物的毒性，廣藿香醇和廣藿香酮在24h時主要表現(xiàn)為生長緩慢、止于體節(jié)期，96h時表現(xiàn)為導致幼魚脊柱側彎，心臟腫大，卵黃囊腫大、擺尾次數(shù)和心率明顯下降等現(xiàn)象；廣藿香油在各時間點主要表現(xiàn)為延緩黑色素的生成和輕微的心臟毒性；對比結果表明，廣藿香酮毒性最明顯。結論：廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚均有胚胎發(fā)育毒性，毒性大?。簭V藿香酮>廣藿香醇>廣藿香油。

【關鍵詞】廣藿香油；廣藿香醇；廣藿香酮；斑馬魚；胚胎發(fā)育毒性

基金項目：國家自然科學基金項目(81403149)；四川省科技廳項目(12JC0613)。

作者簡介：楊雨婷，研究生在讀，主要從事中藥藥理與毒理學研究。

【中圖分類號】R927

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2015)21-0014-03

Abstract:Objective To study the comparation of oil of Pogostemon cablin and its main monomer in Development of Zebrafish Embryos from 0 to 96h post fertilization(96h). Methods The embryos exposure ladder concentrations for the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone at 10h. It were cultured for 96h. LC50,relative survival rate,spontaneous movement of embryos heart beat rate and morphologic change were detected in 10h zebrafish embryos with incubation of the oil of Pogostemon cablin and its main monomer for 96h. Results Control group was established. With the extended time,the toxicity was more obviousely.24h，the LC50 value of the oil of Pogostemon cablin in the zebrafish embryos couldn’t calculate during the exposure concentrations. The LC50 values of Patchouli and Pogostone were 50.3、12.9mg/L, respectively; 24h，The LC50 values of the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone were 21.2、12.9、11.8mg/L, respectively.12 mg/L for the oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone caused malformations in development of embryos, 24h, the embryos was hypoplasia and during the somites; 96h, zebrafish larvae with the characteristic of notochord malformation, cardiac edema, yolk edema. The three drugs inhibited time-dependent, especially Pogostone; 24h,Patchouli and Pogostone caused the reduction of spontaneous movement and heart rate，the oil of Pogostemon cablin had no effect on it. Conclusion The oil of Pogostemon cablin, Patchouli and Pogostone had toxicity on the development of zebrafish embryos,and the toxicity of zebrafish embryos : the oil of Pogostemon cablin >Patchouli>Pogostone.

Keywords:the oil of Pogostemon cablin; Pogostone; Patchouli; Zebrafish; Embryos; Safety

收稿日期：(2015.07.15)

Safety Evaluation of Oil ofPogostemoncablinand its main monomer in Development of Zebrafish Embryos

YANG Yuting1,2HE Yulin1ZHANG Xue1,2LU Junyu1Li Yuzhi1,2HE Beixuan1PENG Cheng1,2CAO Zhixing1,2*

1.Chengdu University of Traditional Chinese Medision,Chengdu 611137,China；

2.State Key Laboratory of Systematic Research and Exploitation of TCM,Chengdu 610075,China

斑馬魚為鯉科短擔尼魚屬，原產于南亞，是一種常見的熱帶魚。斑馬魚為體外受精，胚胎發(fā)育透明，便于觀察，且與人類基因的相似度達到87%，對藥物反應與人臨床反應相似，是毒理學評價的重要模型[1]。同時，斑馬魚個體小，能大規(guī)模繁殖，便于大量獲取實驗所需樣品，有著傳統(tǒng)整體動物和細胞不可比擬的優(yōu)勢，成為當前生命科學研究中常用的三種主要模式脊椎動物之一。

廣藿香是唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的干燥地上部分，其味辛，性微溫，歸脾、肺、胃經[2]，為濕濁中阻嘔吐之要藥，可單用或配伍用于治療妊娠嘔吐屬氣滯濕阻?！侗静輬D經》記載廣藿香為“治脾胃吐逆為最要之藥”。揮發(fā)油是廣藿香的主要有效物質，而廣藿香醇和廣藿香酮為揮發(fā)油中的主要成分[3，4]?，F(xiàn)代研究表明，廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮有抗菌作用；廣藿香醇有抗腫瘤和神經保護的作用[5-8]，具有開發(fā)為抗菌藥物和抗腫瘤藥物的潛力，但安全性尚不清楚。研究采用模式動物斑馬魚，旨在探討和比較廣藿香油及其主要成分的胚胎毒性。

1材料

1.1實驗藥物廣藿香油、廣藿香醇、廣藿香酮(批號：20150130，成都中醫(yī)藥大學藥物研究所)，均以二甲基亞砜(DMSO)配成200 g/L的濃縮液。實驗室用斑馬魚胚胎繁殖培養(yǎng)液 (13.7mmol/L NaCl，0.54 mmol/L KCl，0.025 mmol/L Na2HPO4，0.044 mmol/L KH2PO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，0.42 mmol/L NaHCO3)稀釋。

1.2實驗動物健康AB品系野生型斑馬魚，培育于成都中醫(yī)藥大學斑馬魚實驗室。

1.3儀器Leica 型體視熒光顯微鏡(M165Flc)；斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；MGC-100光照培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.4試劑氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀等試劑均為分析純；二甲基亞砜(DMSO，批號：SZBE0170V，SIGMA公司)。

2方法

2.1胚胎收集依照斑馬魚及相關實驗技術[9]中所述方式，將斑馬魚養(yǎng)殖在控制光周期為14∶10(即光照14h，黑暗10h)，水溫控制在28.5±0.5℃的條件下，每日飼喂新出殼幼蝦兩次。繁殖時，將斑馬魚按雌：雄=1∶1的比例放入繁育盒內，并用隔板分離。次日，光照期開始時，抽去隔板完成交配，3h后吸去糞便等污物，用新鮮培養(yǎng)液沖洗兩次，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度27.5~28.5℃。

2.2給藥將受試藥物的濃縮液用魚卵培養(yǎng)液按二倍梯度稀釋為6個濃度，即100、50、25、12、6、3、1.5mg/L。帶斑馬魚發(fā)育至10h時，按15個/孔置于24孔板，將胚胎分為溶劑對照組、廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮的各劑量組，分別加入相應的藥液，其中溶劑對照組加入DMSO，并設置空白對照。所有胚胎均置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

2.3觀察指標

2.3.1對斑馬魚胚胎發(fā)育的死亡率、存活率及LD50死亡率是藥物對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性最直觀的指標，從10h起連續(xù)培養(yǎng)在對應濃度的對照組和藥液中，分別在24h、48h、72h、96h，于顯微鏡下觀察記錄各組斑馬魚胚胎的死亡和存活情況，并計算不同時間點的LD50。死亡率=死亡數(shù)/胚胎總數(shù)×100%；成活率=成活數(shù)/胚胎總數(shù)×100%。

2.3.2對斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率以上三種藥物斑馬魚胚胎發(fā)育至48h時開始出現(xiàn)畸形，因斑馬魚胚胎發(fā)育至96h基本完成，統(tǒng)計48~96h期間斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率。畸形率=胚胎畸形數(shù)/胚胎總數(shù)×100%。

2.3.3對斑馬魚胚胎發(fā)育的擺尾次數(shù)斑馬魚最初的運動特征為24h的自主抽動，即擺尾次數(shù)，是由脊柱的運動神經支配肌肉系統(tǒng)發(fā)生的。斑馬魚胚胎發(fā)育至24h時尾部開始抽動。記錄24h時每個濃度下1min內斑馬魚胚胎魚尾的擺尾數(shù)。

2.3.4對斑馬魚胚胎發(fā)育的心率48h斑馬魚心臟發(fā)育完全，對于心跳次數(shù)的統(tǒng)計可觀測藥物在胚胎心臟發(fā)育時期的作用的強弱。斑馬魚胚胎發(fā)育至48h，其心臟發(fā)育基本完成。記錄30s內斑馬魚胚胎心臟跳動次數(shù)。

2.4數(shù)據分析采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件包建立數(shù)據庫，采用Bliss法計算LD50；計量數(shù)據采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.1對斑馬魚胚胎發(fā)育的LD50于10h給予不同濃度的廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮，在不同的暴露時間點以胚胎死亡為終點觀察指標，結果顯示，隨著給藥濃度的增加和暴露時間的延長，3種藥物對斑馬魚的致死性越強。24h時，廣藿香酮和廣藿香醇對斑馬魚胚胎的LD50分別為50.3、12.9mg/L，廣藿香油在實驗濃度內未表現(xiàn)出明顯的致死性。96h時，廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚胚胎的LD50分別為21.2、12.9、11.8mg/L，見下表1。結果表明，三個藥物均對斑馬魚均有胚胎發(fā)育毒性，其毒性由大到小分別為廣藿香酮>廣藿香醇>廣藿香油，且毒性與藥物濃度和暴露時間密切相關。

表1　廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚胚胎發(fā)育的LD50(24h、96h)

3.2對斑馬魚胚胎存活率的影響斑馬魚胚胎發(fā)育至10h期時，分別給予12mg/L的廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮，對比相同濃度下三種藥物在24h、48h、72h和96h時對胚胎存活率的影響。結果顯示，在相同作用時間和作用濃度下，毒性從大到小依次為廣藿香酮> 廣藿香醇>廣藿香油(如圖1)。隨著暴露時間延長，斑馬魚胚胎的蓄積毒性增強。

3.3對斑馬魚形態(tài)的影響斑馬魚胚胎發(fā)育至10h期時，分別給予12mg/L的廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮，對比相同濃度下三種藥物在不同時間點對斑馬魚胚胎的致畸性。結果顯示，24h時，對照組正常發(fā)育。廣藿香油組形態(tài)發(fā)育正常，黑色素合成減少；廣藿香醇組發(fā)育止于17-體節(jié)期；廣藿香酮組發(fā)育止于20-體節(jié)期，頭部及尾部開始出現(xiàn)混濁。96h時，對照組形態(tài)和心臟發(fā)育正常， 12mg/L廣藿香油組脊柱微彎，心臟略微腫大；廣藿香醇組脊柱明顯彎曲，心臟腫大，心房和心室發(fā)育畸形；廣藿香酮組脊柱嚴重側彎，卵黃囊腫大，尾部混濁(如圖2)。同時，三種藥物對斑馬魚的致畸率隨著暴露時間的延長而逐漸增加，以廣藿香酮的致畸率最高，廣藿香油的致畸率最低(如圖3)。結果表明，三個藥物對斑馬魚胚胎均具有致畸性，其中廣藿香酮毒性最明顯。

3.4對斑馬魚擺尾次數(shù)的影響斑馬魚胚胎發(fā)育至24h，其尾部會表現(xiàn)出強烈的抽動，當將其暴露于上述藥物時，由于發(fā)育異常而影響此擺尾活動。斑馬魚胚胎10h給予不同濃度的廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮，24h觀察。結果顯示，與正常對照組比較，廣藿香醇和廣藿香酮組斑馬魚胚胎的擺尾次數(shù)顯著減少(P<0.05)，廣藿香油組均數(shù)減少但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表3。

表3　廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮作用24h對斑馬魚擺尾次數(shù)的影響　 ± s)

3.5對斑馬魚心率的影響心臟的跳動是受交感神經和副交感神經的共同調節(jié)。通過心臟跳動的快慢，能夠直接檢測斑馬藥胚胎心臟發(fā)育情況，并間接推斷斑馬魚胚胎神經發(fā)育的情況。斑馬魚胚胎發(fā)育至10h時加藥，于48h在顯微鏡下分別記錄12mg/L濃度下廣藿香油、廣藿香醇或廣藿香酮對斑馬魚胚胎30s內心率的影響。結果顯示，與正常對照組比較，廣藿香酮組和廣藿香醇組斑馬魚胚胎心率均顯著減慢，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，廣藿香油組均值減少但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果見表5。

表5　廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對斑馬魚心率的影響 ± s)

4討論

廣藿香是臨床上常用的芳香化濕藥，主治濕阻中焦引起的惡心嘔吐。廣藿香油是廣藿香的主要藥效物質基礎，并具有抗菌，抗腫瘤，神經保護等新功效?！吨袊幍洹方ㄗh廣藿香藥材的用量為2~6g，對其廣藿香油的用量并無劑量要求。目前，廣藿香藥材的傳統(tǒng)用藥劑量未見毒性報道，但由于新的功效劑量要求與傳統(tǒng)用量存在差異，故對于其進行安全性評價意義重大。國內學者[10-13]用小鼠建立急性毒性模型，研究廣藿香醇口服、腹腔注射均屬低毒藥物。然而由于模型的限制，僅能通過半數(shù)致死量一種指標作為判斷藥物毒性的依據，對于潛在的畸形未能做出統(tǒng)計。據國內文獻報道[11-13]，斑馬魚作為新興的動物模型，已被廣泛用于研究藥物對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性。斑馬魚胚胎發(fā)育整個過程透明可見，且孵化周期短，能在顯微鏡下實時觀察藥物對斑馬魚胚胎作用的致畸和致死變化。通過畸形率、存活率、心率、死亡率等指標推斷斑馬魚毒性蓄積部位及蓄積過程，有助于填補其它動物模型在胚胎發(fā)育毒性評價中的空白。故本實驗采用斑馬魚為模型，探討廣藿香油、廣藿香醇和廣藿香酮對胚胎發(fā)育的影響。

實驗結果表明，在斑馬魚胚胎的整個孵化期，廣藿香醇、廣藿香酮的毒性大于廣藿香油，而廣藿香酮的毒性最大。三種藥物隨時間的增加，其毒性在斑馬魚體內均有蓄積效應，毒性及蓄積效應以廣藿香酮最強，廣藿香醇次之。

綜上，廣藿香油及其廣藿香醇、廣藿香酮對斑馬魚胚胎發(fā)育有致畸毒性和心臟毒性，提示在今后研究中有必要進一步采用其他動物實驗以明確其是否具有胚胎發(fā)育毒性和心臟毒性，為臨床安全用藥提供依據。

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