不同宮頸病變組織中TLR4、TLR9及其信號通路下游因子基因的表達變化

胡建芳1，季瑩2，余敏敏2

(1淮安市婦幼保健院，江蘇淮安223002；2南京市第二醫(yī)院)

摘要：目的觀察不同宮頸病變組織中Toll樣受體(TLR)4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達變化。方法接受婦科手術(shù)或?qū)m頸活檢術(shù)的患者共90例，根據(jù)手術(shù)或活檢宮頸組織病理檢查結(jié)果分為三組：正常組[高危型人乳頭瘤病毒(HPV)陰性、未見上皮內(nèi)病變]30例，宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組(HPV陽性、CIN)30例(CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)，宮頸癌組(HPV陽性、宮頸癌)30例(病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。采用實時熒光定量PCR法檢測三組患者宮頸組織中的TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因。結(jié)果TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三組患者宮頸組織中均有表達，隨著宮頸病變的進展，其表達量均逐漸上升，組間相比，P均<0.05。結(jié)論 TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因表達量隨子宮頸病變進展呈上升趨勢，TLR4、TLR9及其信號通路參與并可能促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。

關(guān)鍵詞：Toll樣受體；Toll樣受體信號通路；人乳頭瘤病毒；高危型人乳頭瘤病毒；宮頸腫瘤；宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.021

中圖分類號：R737.3文獻標志碼：B

基金項目：2014年江蘇省南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項目(YKK14154)。

收稿日期：(2015-06-12)

通信作者：余敏敏

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)長期和持續(xù)感染是宮頸癌的發(fā)病原因之一[1]。Toll樣受體(TLR)參與機體先天性免疫，其在癌組織和正常組織中的表達是有差異的[2]。TLR的異常表達引起免疫紊亂可能導(dǎo)致HPV的持續(xù)感染，誘導(dǎo)腫瘤免疫微環(huán)境的形成，是宮頸癌發(fā)生及進展過程中的一個重要環(huán)節(jié)[3]。本研究對不同宮頸病變組織中TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達變化進行了觀察，探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為宮頸癌的早期診斷及免疫治療提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1 臨床資料2013年1月～2014年5月在南京市第二醫(yī)院和淮安市婦幼保健院接受婦科手術(shù)或?qū)m頸活檢術(shù)的患者共90例，年齡23～77歲。手術(shù)或活檢宮頸組織病理檢查結(jié)果：HPV陰性、未見上皮內(nèi)病變30例(正常組：為子宮肌瘤或肌腺瘤行全子宮切除術(shù)患者)；HPV陽性、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)30例(CIN組：CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)；HPV陽性、宮頸癌30例(宮頸癌組：病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。90例患者術(shù)前未接受過化療和放射治療，并具有完整的臨床資料和病理診斷資料，術(shù)后留取的宮頸組織標本急速冷凍在-80 ℃冰箱中。

1.2宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因檢測方法

1.2.1儀器和試劑StepOnePlus實時定量PCR儀、SYBR GREEN PCR Master Mix和TRIzol(美國ABI公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)，F(xiàn)RESCO17高速冷凍離心機(美國Thermo公司)，Rios5+Mieei-QB超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，微量加樣器、組織勻漿機、分光光度計(德國Eppendorf公司)，MDF-38ZE超低溫冰箱、DH6-9143B5-Ⅲ干燥箱(中國上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2.2引物設(shè)計及合成根據(jù)GeneBank的數(shù)據(jù)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，委托南京銳真生物技術(shù)有限公司合成引物。TLR4上游引物為5′-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3′，下游引物為5′-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3′；TLR9上游引物為5′-CTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3′，下游引物為5′-GGATGCGGTTGGAGGACAA-3′；NF-κB上游引物為5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′，下游引物為5′-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3′；IFN-γ上游引物為5′-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3′，下游引物為5′-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3′；β-actin上游引物為5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物為5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料兩組和多組間的比較分別用雙尾t檢驗和ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三組宮頸組織中均有表達，隨著宮頸病變的進展，其表達量均呈逐漸上升趨勢，四者在三組宮頸組織中的表達比較見表1。

表1　三組宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的相對表達量比較

注：與正常組相比，*P<0.01，**P<0.05；與CIN組相比，△P<0.01。

宮頸癌組中，12例ⅠA～ⅡA期患者與18例ⅡB～Ⅳ期患者宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因表達量相比，P均﹥0.05，見表2。

表2　 不同病理分期宮頸癌患者宮頸組織中TLR4、TLR9、

3討論

99%宮頸癌的發(fā)生與HPV感染有關(guān)[3]。HPV主要通過性接觸傳播。HPV致癌的風(fēng)險與不同年齡和個體之間的自身免疫能力有著密切聯(lián)系，免疫耐受和逃逸可能是HPV持續(xù)感染的關(guān)鍵[4]。固有免疫是機體抵御感染性疾病的第一道防線。TLR是天然免疫系統(tǒng)模式識別受體家族的重要成員之一，TLR7激動劑咪喹莫特被批準用于治療尖銳濕疣，并已被建議用于治療其他HPV相關(guān)性疾病[5]。TLR4可識別細菌的外部成分脂多糖[6]，通過MyD88激活NF-κB、IRF信號通路，導(dǎo)致IL、TNF-α及IFN-γ等細胞因子釋放到胞外，調(diào)節(jié)宮頸癌細胞的增殖、凋亡及免疫逃逸等。TLR9可以特異性識別病毒DNA中非甲基化的CpG-DNA基序并與其結(jié)合，發(fā)生二聚化或多聚化，可同時激活細胞毒性T細胞和輔助T細胞，最后激活NF-κB、IRF等轉(zhuǎn)錄因子，它們可以導(dǎo)致促炎因子的釋放[7]。本觀察發(fā)現(xiàn)，宮頸組織中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的表達隨著宮頸病變的進展呈逐漸上升趨勢。推測TLR4、TLR9及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ參與并可能促進HPV感染的免疫調(diào)控，與HPV持續(xù)感染及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。ⅠA、ⅡA期與ⅡB、Ⅳ期宮頸癌患者宮頸組織中TLR4、TLR9基因及其信號通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表達量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與觀察病例數(shù)偏少有關(guān)；也可能為HPV病毒負荷量逐漸升高，通過與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用，過度激活TLR而致Treg和NK受抑制，進而呈現(xiàn)局部免疫功能異常抑制，免疫系統(tǒng)不能正常識別、清除HPV，使HPV感染持續(xù)存在，宮頸病變不斷進展[8]。

參考文獻：

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