三七總皂苷對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦組織中NF-κB/p50表達(dá)的影響

黃金蘭1，吳登攀1，景鑫2，田新2，鐘振國(guó)2

(1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221004；2廣西中醫(yī)藥大學(xué))

摘要：目的觀察三七總皂苷(PNS)對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦組織中大腦轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p50表達(dá)的影響。方法將60只SAMP8隨機(jī)分為對(duì)照組、PNS高劑量組、PNS低劑量組、石杉?jí)A甲(Huperzine A)組，每組15只。PNS高、低劑量組分別給予PNS 200 mg/kg、100 mg/kg灌胃，Haperzine A組給予Huperzine A 0.03 mg/kg灌胃，對(duì)照組給予相同容積生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)給藥2個(gè)月。灌胃結(jié)束后，取小鼠腦組織。分別采用real-time PCR技術(shù)、Western blotting、免疫組化法檢測(cè)小鼠腦組織中的NF-κB/p50 mRNA、NF-κB/p50 蛋白、NF-κB/p50陽(yáng)性細(xì)胞。結(jié)果PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.61±0.05、1.72±0.19、1.36±0.24、1.85±0.08；PNS高劑量組與對(duì)照組相比，P<0.05；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.01。PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50 蛋白的相對(duì)灰度強(qiáng)度分別為0.696±0.029、0.910±0.038、1.315±0.014、1.436±0.025；PNS高劑量組、PNS低劑量組對(duì)照組相比，P均<0.01；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.05。PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(35±6)、(5±7)、(63±4)、(71±11)個(gè)/HP；PNS高劑量組、PNS低劑量組與對(duì)照組相比，P均<0.01；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.05。結(jié)論 PNS能降低SAMP8腦組織中NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表達(dá)，可能是其下調(diào)淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的作用機(jī)制。

關(guān)鍵詞：三七總皂苷；快速老化癡呆模型小鼠SAMP8；核轉(zhuǎn)錄因子；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R743.9；R912文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460598)；江蘇省新藥與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究課題(ZR-XY201402)；江蘇省教育廳開(kāi)放研究課題(KJS1404)；徐州醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀人才科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(D2014017)。

收稿日期：(2015-07-14)

通信作者：鐘振國(guó)

淀粉樣前體蛋白(APP) 是一類(lèi)與阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Ⅰ型跨膜蛋白，其淀粉源途徑可以生成完整的β淀粉樣蛋白(Aβ)，因此，APP基因的過(guò)表達(dá)與Aβ的產(chǎn)量及AD的神經(jīng)病理改變可能有關(guān)[1]。APP基因5端調(diào)控區(qū)有核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/Rel家族中調(diào)節(jié)因子的特異性結(jié)合部位(即APPκB結(jié)合位點(diǎn))，由NF-κB家族成員p50參與構(gòu)成的復(fù)合物可與APPκB結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合而激活A(yù)PP基因的轉(zhuǎn)錄。我們的前期研究[2]結(jié)果表明,三七總皂苷(PNS)在轉(zhuǎn)錄水平上可以下調(diào)APP的表達(dá)。2013年7月，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察了PNS對(duì)快速老化癡呆模型小鼠SAMP8腦組織中大腦轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p50表達(dá)的影響，探討PNS是否通過(guò)影響NF-κB/p50轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)節(jié)APP mRNA的水平。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器健康雄性快速老化癡呆模型小鼠SAMP8共60只，體質(zhì)量20～30 g。PNS，石杉?jí)A甲(Huperzine A)，NF-κB/p50抗體，β-actin， RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，山羊抗兔IgG。DU-640型紫外分光光度計(jì)，定量PCR儀，轉(zhuǎn)膜儀，電泳儀。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及標(biāo)本采集將60只SAMP8隨機(jī)分為對(duì)照組、PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組(陽(yáng)性對(duì)照)，每組15只。PNS高、低劑量組分別給予PNS 200 mg/kg、100 mg/kg(用雙蒸水調(diào)配)灌胃，Huperzine A組給予Huperzine A 0.03 mg/kg(用雙蒸水調(diào)配)灌胃，對(duì)照組給予與相同容積的生理鹽水灌胃，均每天1次，連續(xù)灌胃2個(gè)月。灌胃結(jié)束后，取小鼠大腦組織備檢。

1.3SAMP8大腦組織中NF-κB/p50 mRNA的檢測(cè)采用real-time PCR技術(shù)。TRIzol試劑盒提取受檢大腦組織總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA純度和含量，按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，然后進(jìn)行PCR(NF-κB/p50上游引物為5′-GCCCCGGCATCC ACC ATG G-3′、下游引物為5′-CAGCTCTGTGGCGCTGGCTT-3′，β-actin上游引物為5′-GCGACGAGGCCCAGAGCAAG-3′、下游引物為5′-GGGGCCACACGCAGCTCATT-3′)： 95 ℃預(yù)熱變性5 min、95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。NF-κB/p50 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以NF-κB/p50 mRNA Ct值與β-actin mRNA Ct值的比值表示。

1.4 SAMP8大腦組織中NF-κB/p50 蛋白的檢測(cè)采用Western bloting。受檢大腦組織裂解、勻漿后轉(zhuǎn)移至EP管，離心、取上清，BCA法檢測(cè)NF-κB/p50 蛋白。對(duì)已提取的NF-κB/p50蛋白進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜等處理，ECL顯色后，掃描條帶，并用Quantity One 4.62分析軟件將圖片上的每條特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.5SAMP8大腦組織中NF-κB/p50陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)及計(jì)數(shù)采用免疫組化法。SAMP8大腦組織經(jīng)石蠟包埋、切片等處理后，免疫組化法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。高倍鏡下(40×)鏡檢，隨機(jī)選取大腦頂葉皮層、海馬周?chē)B續(xù)5個(gè)視野，計(jì)數(shù)5個(gè)視野NF-κB/p50陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)樣本的平均陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。統(tǒng)計(jì)時(shí)將組內(nèi)所有樣本的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相加再計(jì)算出均值代表該組的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)及方差分析(兩兩比較用SNK法)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組SAMP8大腦組織NF-κB/p50 mRNA表達(dá)比較PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.61±0.05、1.72±0.19、1.36±0.24、1.85±0.08；PNS高劑量組與對(duì)照組相比，P<0.05；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.01。

2.2各組SAMP8大腦組織NF-κB/p50 蛋白表達(dá)(圖1)比較PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50 蛋白的相對(duì)灰度強(qiáng)度分別為0.696±0.029、0.910±0.038、1.315±0.014、1.436±0.025；PNS高劑量組、PNS低劑量組與對(duì)照組相比，P均<0.01；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.3各組SAMP8大腦組織NF-κB/p50 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較PNS高劑量組、PNS低劑量組、Huperzine A組、對(duì)照組NF-κB/p50陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(35±6)、(5±7)、(63±4)、(71±11)個(gè)/HP；PNS高劑量組、PNS低劑量組與對(duì)照組相比，P均<0.01；Huperzine A組與對(duì)照組相比，P<0.05。

注：1為對(duì)照組；2為Huperzine A組；3為PNS高劑量組; 4為PNS低劑量組。

圖1各組NF-κB/p50蛋白表達(dá)

3討論

在AD患者大腦中的特定區(qū)域APP基因轉(zhuǎn)錄水平升高，家族性AD患者大腦中的成纖維細(xì)胞APP基因轉(zhuǎn)錄水平也顯著升高。大量表達(dá)的APP經(jīng)過(guò)一系列蛋白水解酶裂解，生成大量含39～43個(gè)氨基酸殘基的Aβ片段，最終形成老年斑[3]。

NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子序列特異性結(jié)合的核蛋白因子，也是Rel蛋白家族成員，參與基因尤其是與機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[4]。已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NF-κB/Rel家族有5個(gè)成員，分別是NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、C-Rel和Rel-B。在APP基因5端調(diào)控區(qū)有APPκB結(jié)合位點(diǎn)，由p50參與構(gòu)成的復(fù)合物可與該位點(diǎn)特異性結(jié)合而激活A(yù)PP轉(zhuǎn)錄。

我們的前期研究[2]證實(shí)PNS在轉(zhuǎn)錄水平上可以下調(diào)APP的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PNS高劑量組的NF-κB/p50 mRNA表達(dá)降低，PNS高、低劑量組的NF-κB/p50 蛋白表達(dá)降低且陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少。提示PNS能下調(diào)SAMP8大腦組織NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表達(dá)。Huperzine A可改善多種認(rèn)知功能缺陷動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶功能，在我國(guó)已用于AD的治療[5]。本研究結(jié)果表明，Huperzine A亦可下調(diào)SAMP8大腦NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表達(dá)。推測(cè)PNS有可能通過(guò)降低轉(zhuǎn)錄因子NF-κB/p50水平而下調(diào)APP mRNA的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Soldano A, Hassan BA. Beyond pathology: APP, brain development and Alzheimer′s disease [J]. Curr Opin Neurobiol, 2014,27(6):61-67.

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[3] Shahani N, Seshadri S, Jaaro-Peled H, et al. DISC1 regulates trafficking and processing of APP and Aβ generation [J]. Mol Psychiatry, 2015,20(7):874-879.

[4] Pateras I, Giaginis C, Tsigris C, et al. NF-κB signaling at the crossroads of inflammation and atherogenesis: searching for new therapeutic links [J]. Expert Opin Ther Targets, 2014,18(9):1089-1101.

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