納米鉛在小鼠肝臟的吸收和代謝

王桂芳王黎輝①楊娜王吉順①李清釗②

(河北省秦皇島市出入境檢驗檢疫局煤炭檢測技術(shù)中心河北秦皇島066003；①河北鋼鐵集團唐銀公司；②華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

[摘要]①目的檢測不同時間點可溶性及不可溶性納米硫化鉛在小鼠肝臟的代謝，探討納米鉛的毒代動力學(xué)差異。②方法選擇雄性昆明小鼠69只，體質(zhì)量約20g。將小鼠隨機分為3個組別，每組23只小鼠。分別為未包裹的不可溶性納米硫化鉛(PbSⅠ)、巰基乙酸包裹的可溶性納米硫化鉛(PbSⅡ)、巰基乙醇包裹的可性納米硫化鉛(PbSⅢ)3組。采用腹腔注射法進行一次性染毒。各染毒組分別注入相應(yīng)濃度納米PbS顆粒懸浮液0.4mL(按200mg/kg給藥)。于染毒后第0.5、1、6、12、24、36、48h處死，取其肝臟。經(jīng)消化后，用7500型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測各組的肝中鉛元素的含量。③結(jié)果隨著小鼠腹腔染毒后時間的增加，肝樣品中鉛元素含量呈上升到一定峰值后逐漸降低的趨勢。觀察小鼠腹腔染毒后48小時內(nèi)7個時間點的鉛元素含量，3組肝樣品中鉛濃度存在以下關(guān)系：未包裹組>巰基乙酸組>巰基乙醇組。毒代動力學(xué)鉛-時曲線符合一級吸收二室模型；毒代動力學(xué)參數(shù)顯示，巰基乙醇組代謝最快，分布范圍最廣，而未包裹組代謝最慢，分布范圍最廣。④結(jié)論可溶性比不可溶性納米硫化鉛在肝中的含量低，代謝速度快。

[關(guān)鍵詞]納米硫化鉛 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 毒代動力學(xué)

[中圖分類號]R 181[文獻標(biāo)識碼]B

【作者簡介】王桂芳，女(1963-)，工程師。主要研究方向：煤炭檢測。

【通訊作者】李清釗。

納米粒子是指粒子的晶體結(jié)構(gòu)至少有一維處于在 0.1~100nm之間的材料，納米粒子作為新型材料有廣泛的用途，也對人體健康以及環(huán)境帶來了潛在影響，國內(nèi)外的科學(xué)界和政府部門已經(jīng)廣泛關(guān)注納米的應(yīng)用前景以及對健康的潛在影響[1]，自2000年以來，國內(nèi)外對于納米材料的生物安全性和毒理學(xué)問題也展開了日益深入的討論和研究[2,3]。

本課題利用電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀(ICP-MS)[4~6]檢測不同時間點肝中鉛的含量，為研究納米硫化鉛在體內(nèi)代謝提供依據(jù)。

1對象與方法

1.1研究對象清潔級健康雄性小鼠69只，體質(zhì)量約20g，購自：北京華阜康實驗有限公司，動物號SCXK(京)2009-00041.2 主要試劑 PbSⅠ，未包裹的納米PbS(粒徑30nm)；PbSⅡ，巰基乙酸包裹的納米PbS(粒徑30nm)；PbSⅢ，巰基乙醇包裹的納米PbS(粒徑30nm)，由南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院提供。硝化液：濃硝酸、高氯酸(比例為4：1)?？鼓齽焊嗡?。

1.2主要器材電子天平、電熱板、離心機、7500型電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀(ICP-MS)(美國Agility公司產(chǎn)品)。

1.3方法

1.3.1動物的分組及染毒。實驗開始前將小鼠進行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)。隨機分為3組，分別為PbSⅠ(納米硫化鉛)、PbSⅡ(巰基乙酸包裹的納米硫化鉛)、PbSⅢ(巰基乙醇包裹的納米硫化鉛)組3個組別，每組23只。塑料籠飼養(yǎng)，自由進食飲水，飼養(yǎng)室溫度在22℃左右，環(huán)境干燥，通風(fēng)良好。

1.3.1.1藥物溶劑的配制。生理鹽水配置成濃度10mg/mL的混濁液，經(jīng)過充分的超聲振蕩使液體均勻。

1.3.1.2動物的染毒。按上述分組，每組分別一次性腹腔注射3種不同的納米硫化鉛約0.4mL(按200mg/kg給藥)。

1.3.2毒代動力學(xué)實驗和組織分布實驗。于鼠腹腔注射染毒后第0.5、1、6、12、24、36、48h，每個時間點取6只小鼠，小鼠采血后，取其肝，純凈水洗凈組織表面的殘血, 用濾紙將水分吸干后，于冰箱中冷凍-20℃保存待測。用電子天平稱重肝樣品置于錐形瓶中，在其中加入消化液在電熱板上進行消化至消化液變?yōu)闊o色且恰好蒸干。消化完畢冷卻后，用10%的鹽酸溶液定容至10mL，離心10min(2000r/min)，再用微量移液器吸取0.5mL稀釋至5mL，用7500型電感耦合等離子發(fā)射體質(zhì)譜儀(ICP-MS)進行鉛的定量分析。

1.3.3ICP-MS儀的工作條件。本次實驗用美國生產(chǎn)的7500型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定肝中鉛元素的含量，該儀器的主要參數(shù)：載氣1.18L/min，輔助氣1.14L/min，等離子氣15.0L/min，等離子體發(fā)生器發(fā)射功率1400W，霧化器SCF，霧室溫度2.5℃，內(nèi)標(biāo)液209Bi，溶液的進樣速度1mL/min，進樣時間1min，稀硝酸沖洗時間30s，超純水沖洗時間30s。

1.3.4樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使鉛的濃度為1μg/mL、20μg/mL、60μg/mL、100μg/mL，上機進行測定，以強度為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制樣品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液回歸方程Y=3.701E-0.03X+8.871E-0.05，r=0.9999)。

1.3.5樣品的測定。肝消化液測定條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線，儀器自動打印出分析結(jié)果，根據(jù)肝臟質(zhì)量計算出其中鉛元素的濃度。

1.3.6統(tǒng)計學(xué)處理。一次腹腔給藥后，測得不同時間點鉛的肝中濃度數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用3p97軟件處理房室模型并計算藥代動力學(xué)參數(shù)Ke(速率常數(shù))、T1/2(半衰期Half life)、AUC(曲線下面積Area Under Curve)、V(分布容積)、CL(清除率Clearance)，然后用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察方法學(xué)考察包括建立方法的專屬性、線性、最低檢測限、回收率、精密度和穩(wěn)定性[9]。經(jīng)過方法學(xué)考察，所建立的方法專屬性好，本方法靈敏度高，檢出限為0.15μg/L。連續(xù)2d檢測方法的日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，說明穩(wěn)定性好，符合生物樣品分析的要求。所作標(biāo)準(zhǔn)曲線r≥0.99。

表1　不同時間點的肝臟中 鉛含量測定結(jié)果

由表1和圖1可知，隨著染毒時間的增加，PbSⅡ處理的鼠的肝臟中鉛的濃度在1h達到峰值。PbSⅠ、PbSⅢ處理的鼠的肝臟中鉛的濃度在6h達到峰值，隨后鉛元素含量呈逐漸降低的趨勢。達到峰值時PbSⅠ處理組的鉛的濃度最高，PbSⅢ處理組的鉛的濃度最低。

注：圖1　肝臟中鉛元素的鉛-時曲線(μg/g)

2.3動力學(xué)參數(shù)小鼠腹腔一次給藥后肝臟毒代動力學(xué)參數(shù)，見表2。

2.4結(jié)果3個組別的肝中的鉛元素濃度關(guān)系總體上是：未包裹組> 巰基乙酸組>巰基乙醇組。不可溶性納米硫化鉛比可溶性納米硫化鉛在肝中消除慢、代謝慢、停留時間長且含量高?？扇苄约{米硫化鉛中，巰基乙醇包裹的比巰基乙酸包裹的在肝中的代謝速度快、消除快、停留時間短、含量低。

3討論

目前納米粒子的毒性、安全性研究還處于起步階段，納米技術(shù)的發(fā)展需要健全、合理的規(guī)范，建立納米材料的安全標(biāo)準(zhǔn)是亟待解決問題。硫化鉛具有刺激性，急性中毒可引起惡心、頭痛和嘔吐，長期鉛蓄積可引起記憶力減退以及慢性肝腎損害。進入機體組織中的鉛,主要通過肝臟代謝，腎臟排泄[7]。同時肝臟、腎臟也是鉛在體內(nèi)蓄積的部位, 尤其是早期接觸的鉛主要蓄積于腎、肝等軟組織中[7]，在人體中蓄積的半衰期達15年。本實驗中，小鼠一次腹腔給藥后，使用ICP-MS測得不同時間點鉛元素在血液中濃度數(shù)據(jù)，并用3p97軟件處理房室模型并計算毒代動力學(xué)參數(shù)。

表2　小鼠腹腔注射給藥后肝臟的毒代動力學(xué)參數(shù)

注：與PbSⅠ相比，*P<0.01；與PbSⅡ相比，#P<0.01

實驗結(jié)果顯示,PbSⅠ、PbSⅡ、PbSⅢ，小鼠體內(nèi)為一級二室模型，筆者用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，根據(jù)所獲得的毒代動力學(xué)參數(shù)經(jīng)方差分析可知，PbSⅠ體內(nèi)代謝的時間最長，提示PbSⅠ在體內(nèi)消除慢、代謝慢、停留時間長，各組肝中鉛元素的含量PbSⅠ>PbSⅡ>PbSⅢ。毒代動力學(xué)參數(shù)顯示，用巰基乙酸和巰基乙醇修飾后的納米PbS在體內(nèi)代謝速度快，蓄積量低，納米PbS通過表面的Pb-連接巰基，借助其外端的-COOH和-OH，具有良好的水溶性，并能與生物大分子結(jié)合。因而在血液及組織臟器中的代謝速率要比不可溶性納米硒化鎘要快，親水效果越好代謝也越快，因為-OH的親水效果好于-COOH，所以巰基乙醇包裹后的代謝效果好于巰基乙酸，沒有包裹的納米硒化鎘在小鼠體內(nèi)代謝慢，且肝靶向明顯。資料顯示巰基對于鉛急性中毒具有解毒作用，研究發(fā)現(xiàn)，鉛染毒后立即給巰基，BAL(一種限制性內(nèi)切酶)能顯著降低小鼠肝中鉛的含量，提高急性鉛染毒小鼠的存活率[8]。因而不可溶性納米材料較可溶性納米材料急性毒性大，本實驗也印證了這一結(jié)論。綜上所述，用巰基包裹的納米硫化鉛的毒性要遠遠低于納米硫化鉛的毒性。本結(jié)果為減少納米材料的毒性，為納米硫化鉛的安全使用提供科學(xué)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

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(2015-04-28收稿)(王一伊編輯)