米諾環(huán)素后處理通過抑制PARP過度活化減輕心肌缺血/再灌注損傷*

張利群1△，陳冬2，齊國先3

(1沈陽醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院人文教研室，遼寧 沈陽 110034； 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2中心實(shí)驗(yàn)室，3心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001)

[摘要]目的： 探討米諾環(huán)素后處理能否通過抑制多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)過度活化減輕大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)損傷。方法: 結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支45 min，再灌注2 h，建立心肌I/R模型。將90只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組, I/R組，低、高劑量米諾環(huán)素組及PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-AB)組。氯化三苯基四氮唑(TTC)和伊文思藍(lán)雙染法檢測心肌梗死范圍，HE 染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變，TUNEL 法評(píng)估心肌細(xì)胞凋亡程度，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)含量，Western blot法檢測再灌注心肌及外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1活化產(chǎn)物多腺苷二磷酸核糖(PAR)的表達(dá)。結(jié)果: 與sham組比較，心肌、外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)及血清TNF-α、IL-1β含量明顯升高。與I/R組比較，米諾環(huán)素低、高劑量及3-AB后處理組均能顯著減少梗死范圍及心肌細(xì)胞凋亡程度，同時(shí)明顯降低心肌、外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)及血清TNF-α、IL-1β含量。米諾環(huán)素高劑量組與3-AB組比較無顯著差異。結(jié)論: 米諾環(huán)素后處理可能通過抑制心肌及外周血白細(xì)胞PARP過度活化減輕大鼠心肌I/R損傷。

[關(guān)鍵詞]多腺苷二磷酸核糖聚合酶； 米諾環(huán)素； 后處理； 心肌缺血再灌注損傷

[中圖分類號(hào)]R363[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.014

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-2016-05

[收稿日期]2015-04-23[修回日期] 2015-08-24

通訊作者△Tel: 0759-2633626; E-mail: 276798575@qq.com

Minocycline postconditioning protects myocardium from ischemia-reperfusion injury through attenuating poly(ADP-ribose) polymerase excessive activationZHANG Li-qun1, CHEN Dong2, QI Guo-xian3

(1DepartmentofHumanity,SchoolofNursing,ShenyangMedicalCollege,Shenyang110034,China;2CentralLaboratory;3DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:sunflowerzlq@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate whether minocycline postconditioning protects rat myocardium from ischemia-reperfusion (I/R) injury through attenuating poly(ADP-ribose)polymerase-1 (PARP-1) excessive activation. METHODS: The left anterior descending coronary artery was ligated for 45 min and then reopened for 2 h to establish the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury. The male Wistar rats (n=90) were randomly divided into sham group, I/R group, low- and high-dose minocycline groups, and 3-aminobenzamide (3-AB, PARP inhibitor) group. The myocardial infarct size was measured by Evans blue and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. The morphological changes of the myocardium were observed with HE staining. The cardiomyocyte apoptosis was detected using in situ TDT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The level of tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin 1β (IL-1β) in the serum were measured by ELISA. The content of poly(ADP-ribose) (PAR) in the reperfused myocardium and peripheral leukocytes were detected by Western blot. RESULTS: Compared with sham group, PAR expression, TNF-α content and IL-1β concentration increased in all other groups. Compared with I/R group, treatment with low and high doses of minocycline and 3-AB significantly reduced the infarct size and myocardial apoptosis. PAR expression, TNF-α content and IL-1β concentration in low- and high- dose minocycline groups and 3-AB group all decreased. No significant difference of the above parameters between high-dose minocycline group and 3-AB group was observed. CONCLUSION: Minocycline postconditioning may attenuate myocardial ischemia-reperfusion injury by depressing the activation of PARP-1 in cardiomyocytes and peripheral leukocytes in rats.

[KEY WORDS] Poly(ADP-ribose) polymerase; Minocycline; Postconditioning; Myocardial ischemia-reperfusion injury

目前缺血性心臟病已成為導(dǎo)致人類死亡的首位原因，心肌再灌注治療使其死亡率下降了幾乎接近一半。然而，再灌注猶如一把雙刃劍，由此引發(fā)的額外心肌損傷顯著削弱了由其帶來的臨床益處[1-2]。心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷發(fā)病機(jī)制的研究仍然是心血管領(lǐng)域的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。前臨床研究證實(shí)，心肌I/R可以使心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧和氮簇，這些物質(zhì)誘導(dǎo)的DNA損傷將激活核酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1][3]，PARP-1活化并不只局限于心肌局部，外周血白細(xì)胞內(nèi)也存在PARP-1活化產(chǎn)物PAR的過度表達(dá)[4-5]。PARP-1過度活化成為缺血再灌注介導(dǎo)細(xì)胞功能障礙和死亡的一個(gè)關(guān)鍵途徑，PARP-1抑制劑可能成為心肌缺血再灌注損傷急性心肌保護(hù)的重要治療手段[3]。新近發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)源性和外源性因子能調(diào)節(jié)PARP-1活性[6]，其中四環(huán)素類抗生素即為一類調(diào)節(jié)PARP-1活性的外源性因子。

米諾環(huán)素(minocycline，M)是一種半合成的四環(huán)素衍生物，最近研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素能減輕I/R對(duì)心肌的損傷[7]，但其多采用預(yù)處理與腹腔注射方式給藥，并且使用劑量是臨床常規(guī)抗感染、抗炎劑量的30倍[8]。因此，本研究首次采用低劑量米諾環(huán)素3 mg/kg，相當(dāng)于臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)劑量200 mg[8]，觀察其后處理對(duì)I/R心肌的作用，并探討其對(duì)再灌注心肌及循環(huán)血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)及血清炎癥細(xì)胞因子的影響，為米諾環(huán)素防治心肌再灌注損傷的可行性和臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

材料和方法

1動(dòng)物、試劑及儀器

雄性Wistar大鼠90只，體重300～340 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸米諾環(huán)素、PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide，3-AB)、Histopaque-1083和2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride， TTC)購自Sigma；單克隆小鼠抗大鼠PAR購自Alexis Biochemicals；伊文思藍(lán)(Fluka)；大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(購自R&D)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成科技有限公司)；TUNEL試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica)；光學(xué)顯微鏡(Olympus)；酶標(biāo)儀(ThermoLab System)。

2I/R大鼠模型的制備和實(shí)驗(yàn)分組

大鼠用10%水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉，氣管切開插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，潮氣量10 mL/kg，吸呼比1∶1.5，呼吸頻率75 min-1。在第4肋間行左胸廓切開術(shù)，暴露心臟，打開心包，擠出大部分心臟,暴露肺動(dòng)脈圓錐與左心耳根部間的左冠狀靜脈。以左冠狀靜脈為標(biāo)志，用5-0縫線在左冠狀靜脈下穿線，連同左冠狀靜脈一起在距冠狀動(dòng)脈前降支根部1～2 mm形成一個(gè)直徑約5 mm的活結(jié)，將穿有27 G針管長度約5 mm的硅膠管置于活結(jié)中，結(jié)扎后，見左室游離壁立即變白 (或發(fā)紺)及心電圖ST段抬高或QRS波寬高畸形并持續(xù)存在為結(jié)扎成功。45 min后拔出硅膠管，使冠狀動(dòng)脈血流再通，再灌注時(shí)局部組織充血及心電圖ST段回落或QRS變窄。全程監(jiān)測大鼠肛溫，通過熱墊和臺(tái)燈維持大鼠體溫在37 ℃～38 ℃。假手術(shù)組動(dòng)物手術(shù)全過程與其它組相同，但只穿線不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(sham)組、缺血再灌注(I/R)組、低劑量(3 mg/kg)米諾環(huán)素(low-dose minocycline, LM)后處理(LM+I/R)組、高劑量(10 mg/kg)米諾環(huán)素(high-dose minocycline, HM)后處理(HM+I/R)組、3-AB(20 mg/kg)后處理(3-AB+I/R)組，每組各18只。各組于再灌注前10 min由股靜脈注射給藥，I/R組給等量生理鹽水，每2 h給藥1次，共給藥2次。再灌注2 h后頸靜脈取血用于外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR及血清細(xì)胞因子檢測，之后隨機(jī)取6只進(jìn)行組織病理形態(tài)學(xué)檢測及心肌凋亡細(xì)胞原位測定，6只大鼠行心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)、梗死范圍測定，6只大鼠行再灌注心肌PAR測定。

3主要方法

3.1血標(biāo)本和外周血白細(xì)胞準(zhǔn)備再灌注2 h后，先從頸靜脈取血5 mL置于肝素化試管中，使用Histopaque-1083分離單個(gè)核細(xì)胞[4]。具體操作：將5 mL Histopaque-1083置于離心管底部，小心輕移5 mL抗凝全血至其頂部，注意避免混合，室溫下以800×g離心15 min，后用吸管抽吸血漿層至0.5 cm厚包含單個(gè)核細(xì)胞的不透明層，將單個(gè)核細(xì)胞移進(jìn)清潔的離心管，再懸浮于磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)內(nèi)，室溫下以250×g離心10 min，用PBS沖洗2次后，分離的單個(gè)核細(xì)胞使用梯度降溫法后于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)、梗死范圍測定再灌注2 h后，再次原位結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，從左心室腔注入2%伊文氏蘭3 mL，未缺血心肌組織染成藍(lán)色，缺血心肌不染色，即為缺血危險(xiǎn)區(qū)。剪去右心室和心房，凍存后切厚度為2 mm的橫斷面切片4～5個(gè)，缺血左室部分置于37 ℃下1%的TTC溶液中孵育20 min，染色后將心臟切片以10%甲醛溶液固定6 h。白、紅和藍(lán)3種顏色分別代表梗死區(qū)、非梗死的缺血區(qū)和非缺血區(qū)，非梗死的缺血區(qū)和梗死區(qū)一起作為缺血危險(xiǎn)區(qū)(area at risk, AAR)。缺血危險(xiǎn)區(qū)用缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量與左室重量之比(AAR/LV)表示，而梗死范圍(infarct size,IS)用梗死區(qū)心肌重量與缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量之比(IS/AAR)表示。

3.3心肌組織病理形態(tài)學(xué)的測定再灌注2 h后，迅速留取左心室前壁缺血中心區(qū)同一部位全層心肌組織，4%的多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察缺血區(qū)心肌形態(tài)學(xué)和炎癥細(xì)胞浸潤情況。

3.4心肌凋亡細(xì)胞原位測定再灌注2 h后，迅速留取左心室前壁缺血中心區(qū)同一部位全層心肌組織，4%的多聚甲醛固定12 h，石蠟包埋，用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，棕色為TUNEL染色凋亡細(xì)胞，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡陽性細(xì)胞，以凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。

3.5血清TNF-α和IL-1β含量測定再灌注2 h，頸靜脈取血2 mL，靜置后4 ℃下3 000 r/min，離心10 min分離出血清，應(yīng)用 ELISA 法檢測血清TNF-α和IL-1β含量，檢測方法按照檢測試劑盒使用說明進(jìn)行。

3.6心肌和外周血白細(xì)胞的PARP活化產(chǎn)物PAR測定采用Western blot方法檢測各組再灌注心肌和外周血白細(xì)胞的PAR表達(dá)。分別取心肌組織或細(xì)胞勻漿液離心后應(yīng)用Bradford 進(jìn)行蛋白含量檢測。取蛋白20 μL(50 μg)上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠上，電泳電壓120 V，轉(zhuǎn)膜后封閉，按照1∶400稀釋PAR，1∶2 000稀釋?duì)?actin抗體37 ℃孵育1 h，放入4 ℃冰箱過夜進(jìn)行 I 抗雜交，取相對(duì)應(yīng) II 抗雜交，ECL發(fā)光，將膠片于成像系統(tǒng)中拍照，以 Quantity One 4.6.2 成像軟件分析電泳帶的灰度值，選擇PARP-1自身糖基化在內(nèi)的高分子量片段，即116 kD以上灰度值與相應(yīng)的β-actin的灰度值的比值為各個(gè)樣本PAR的表達(dá)量。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠心肌損傷的影響

1.1心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變光鏡下觀察，sham組的心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻，肌纖維橫紋清晰，無細(xì)胞腫脹，未見變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤；I/R組的心肌肌纖維排列紊亂，著色不均勻，細(xì)胞腫脹明顯，心肌細(xì)胞間隙水腫嚴(yán)重，肌纖維部分?jǐn)嗔?，橫紋模糊或消失，可見心肌細(xì)胞呈片狀壞死，壞死區(qū)細(xì)胞核碎裂或崩解，周圍有炎性細(xì)胞浸潤； LM+I/R組、HM+I/R組及3-AB+I/R組的心肌細(xì)胞排列基本規(guī)整，部分心肌細(xì)胞水腫變性，肌纖維間隙水腫，但明顯少于I/R組，炎性細(xì)胞浸潤減少。與I/R組相比，心肌組織結(jié)構(gòu)明顯改善，見圖 1。

Figure 1.The effects of minocycline on myocardial injury in rats.

圖1米諾環(huán)素對(duì)大鼠心肌組織損傷的影響

1.2心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死范圍各組大鼠心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)范圍的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與I/R組比較，LM+I/R組、HM+I/R組及3-AB+I/R組均能顯著減小梗死范圍(P<0.05)；與LM+I/R組比較，HM+I/R組減小梗死范圍更顯著(P<0.05)。HM+I/R組與3-AB+I/R組比較無顯著差異，見圖2、表1。

Figure 2.The effects of minocycline on myocardial area at risk and infarct size in the rats.

圖2米諾環(huán)素對(duì)大鼠心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死范圍的影響

表1米諾環(huán)素對(duì)大鼠心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)、梗死范圍和血清TNF-α、IL-1β含量的影響

Table 1.The effects of minocycline on myocardial area at risk, infarct size and serum contents of TNF-α and IL-1β in the rats (Mean±SD)

TreatmentAAR/LV(%.n=6)IS/AAR(%.n=6)TNF-α(ng/L.n=12)IL-1β(ng/L.n=12)Sham——52.34±6.2744.38±5.18I/R51.18±4.9458.48±5.39234.34±24.79*153.13±11.98*LM+I/R49.23±3.3641.50±4.30#163.59±12.87*#91.74±9.23*#HM+I/R49.45±3.6433.11±3.94#△129.18±7.56*#△73.05±9.05*#△3-AB+I/R50.06±5.2237.58±3.88#138.57±8.58*#77.16±9.62*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsLM+I/R group.

1.3大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)TUNEL染色后正常細(xì)胞核染藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕色。Sham組大鼠心肌中極少量TUNEL染色陽性細(xì)胞，I/R組大鼠染色陽性細(xì)胞明顯增多，AI明顯增高(P<0.05)；與I/R組比較，LM+I/R組、HM+I/R組及3-AB+I/R組染色陽性細(xì)胞明顯減少，AI明顯降低(P<0.05)。HM+I/R組與3-AB+I/R組比較差異不顯著(P>0.05),見圖3。

2米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-1β的影響

與sham組比較，I/R組血清TNF-α和IL-1β含量均明顯增高(P<0.05)；與I/R組比較，LM+I/R組、HM+I/R組及3-AB+I/R組血清TNF-α和IL-1β含量顯著降低(P<0.05)；與LM+I/R組比較，HM+I/R組更能顯著減小血清TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)。HM+I/R組與3-AB+I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

3米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠外周血白細(xì)胞PAR表達(dá)的影響

與sham組比較， I/R組外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與I/R組比較，LM+I/R組、HM+I/R組和3-AB+I/R組均能顯著減低外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)(P<0.01)；與LM+I/R組比較，HM+I/R組減小外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)更顯著(P<0.05)。HM+I/R組與3-AB+I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

4米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠再灌注心肌PAR表達(dá)的影響

與sham組比較， I/R組再灌注心肌內(nèi)PAR表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與I/R組比較，LM+I/R組、HM+I/R組和3-AB+I/R組均能明顯減低再灌注心肌內(nèi)PAR表達(dá)(P<0.01)；與LM+I/R組比較，HM+I/R組減小再灌注心肌內(nèi)PAR表達(dá)更顯著(P<0.05)。HM+I/R組與3-AB+I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。

討論

目前認(rèn)為能量代謝障礙、氧自由基生成增多和細(xì)胞內(nèi)鈣超載是I/R損傷發(fā)生的主要機(jī)制[9-10]，以上機(jī)制多涉及I/R損傷的上游，其下游更接近細(xì)胞死亡的機(jī)制仍不十分清楚。PARP-1是一種存在于除酵母外所有真核細(xì)胞核內(nèi)的蛋白酶，對(duì)維持細(xì)胞染色體穩(wěn)定、DNA 修復(fù)和復(fù)制、細(xì)胞凋亡和死亡及基因轉(zhuǎn)錄起重要作用[11]。研究證實(shí)I/R后生成的自由基可以導(dǎo)致DNA斷裂, 進(jìn)而激活PARP-1。PARP-1活化是包括缺血/再灌注、循環(huán)休克和系統(tǒng)炎癥等各類組織損傷的最終共同效應(yīng)分子。PARP-1過度活化，一方面，消耗其底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)，減低糖酵解、電子傳遞和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)形成的速率，同時(shí)合成大量PARP活化產(chǎn)物PAR，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和死亡；另一方面，PARP-1活化對(duì)炎癥調(diào)節(jié)途徑起重要的作用[3]。PARP抑制劑即通過干預(yù)壞死和炎癥使此類疾病獲益。

Figure 3.The effects of minocycline postconditioning on the myocardial cell apoptosis in the rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖3米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

研究發(fā)現(xiàn)再灌注早期PARP即顯著活化，PARP-1活化主要出現(xiàn)在再灌注期，而非缺血期[12]，再灌注早期PARP的快速并持續(xù)的活化，證明再灌注本身在心肌缺血損傷的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重了心肌的損傷，以上不僅證實(shí)了再灌注損傷的存在，而且提示再灌注將引發(fā)嚴(yán)重的致死性心肌損害。PARP-1活化為再灌注損傷所特有改變，這更強(qiáng)調(diào)了PARP-1活化在再灌注損傷中的作用，并且再灌注后持續(xù)高表達(dá)的PAR可能與再灌注后心肌梗死范圍擴(kuò)大相關(guān)。自從1997年首次報(bào)道了PARP抑制劑3-AB通過對(duì)心肌PARP活性的抑制減少心肌梗死范圍[13]，其后，許多對(duì)嚙齒動(dòng)物以及大型動(dòng)物模型的研究進(jìn)一步證實(shí)了不同的PARP抑制劑對(duì)缺血和再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用[11]。Ikai等[14]于1980年對(duì)正常人和大鼠外周血內(nèi)PAR的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)存在極少量的PAR表達(dá)，而中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞內(nèi)未檢測到PAR。Murthy等[4]2004年首次報(bào)道了大鼠心肌缺血再灌注后外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)顯著增加。人類研究結(jié)果也提示血管的再通啟動(dòng)氧化/氮化應(yīng)激，心肌再灌注干預(yù)能產(chǎn)生系統(tǒng)的氧化反應(yīng)，急診再血管化患者再灌注早期外周血白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)顯著增高，而慢性心肌缺血擇期再血管化患者再灌注早期并未出現(xiàn)PARP-1活化[5]。以上研究再次證實(shí)PARP-1活化是急性心肌缺血再灌注后的產(chǎn)物，同時(shí)也可能成為致死性再灌注損傷存在的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者循環(huán)血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1活化與心梗后系統(tǒng)中增加的炎癥因子相關(guān)。急性ST段抬高心肌梗死患者應(yīng)用新型PARP-1抑制劑INO-1001的臨床研究提示[15]，抑制PARP-1未見明顯減少心肌損傷標(biāo)志物的水平，但能顯著降低患者血漿C反應(yīng)蛋白和炎癥標(biāo)志物白細(xì)胞介素6的水平，上述研究揭示了外周血PARP-1活化在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病過程中的重要作用。

Figure 4.The effects of minocycline postconditioning on poly(ADP-ribose) (PAR) expression in peripheral leukocytes in the rats. Mean±SD.n=12.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsLM+I/R group.

圖4米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠外周血白細(xì)胞PAR表達(dá)的影響

Figure 5.The effects of minocycline postconditioning on poly(ADP-ribose) (PAR) in the reperfused myocardium in the rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsLM+I/R group.

圖5米諾環(huán)素后處理對(duì)大鼠再灌注心肌PAR表達(dá)的影響

本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈建立心肌I/R損傷模型，對(duì)再灌注心肌及外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP活化的最終產(chǎn)物PAR及血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示再灌注心肌與外周血白細(xì)胞中PARP-1同時(shí)被激活，提示心肌局部再灌注損傷足以引發(fā)系統(tǒng)外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1的活化，心肌缺血再灌注導(dǎo)致局部心肌產(chǎn)生大量氧化/氮化應(yīng)激產(chǎn)物，再灌注使血液流經(jīng)缺血心肌，心肌中持續(xù)的自由基和氧化氮化產(chǎn)物引起外周血中單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，DNA單鏈斷裂進(jìn)而導(dǎo)致了PARP的活化，同時(shí)早期大量的DNA單鏈斷裂所致的持續(xù)未修復(fù)狀態(tài)也可能成為PARP持續(xù)活化的基礎(chǔ)。循環(huán)白細(xì)胞內(nèi)的PARP活化可能進(jìn)一步介導(dǎo)缺血再灌注損傷的某些系統(tǒng)效應(yīng)，如炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及遠(yuǎn)隔器官的損傷。本研究結(jié)果提示外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1的活化與系統(tǒng)中增高的炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β相關(guān)，抑制PARP-1的活化的同時(shí)也明顯降低了血清中的炎癥細(xì)胞因子表達(dá)。以往研究顯示抑制PARP-1活化能調(diào)節(jié)前炎癥基因和蛋白的活化和表達(dá)，其中NF-κB是調(diào)節(jié)這些蛋白的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，PARP-1的缺乏或其藥理學(xué)抑制能壓低NF-κB的活化，抑制前炎癥基因的表達(dá)[16]。本課題組前期研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，再灌注早期外周血白細(xì)胞PARP-1活化產(chǎn)物PAR的表達(dá)與心肌梗死大小具有相關(guān)性，白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)與心肌PAR表達(dá)存在相關(guān)性[17]。

在臨床上米諾環(huán)素主要用于治療關(guān)節(jié)炎及其它感染性疾病，近年發(fā)現(xiàn)其除抗菌作用外還具有抗炎、抗凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑以及氧自由基清除等多效性，因其具有的高度親脂性和組織中高濃度分布特性而備受關(guān)注[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素預(yù)處理不僅對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[18]，對(duì)缺血再灌注損傷腎臟[19]及心肌也有保護(hù)作用。然而，在急性缺血性心肌損傷中米諾環(huán)素均應(yīng)用劑量(45～90 mg/kg)較高，是臨床常規(guī)抗感染、抗炎劑量的30倍，且多采用腹腔注射或經(jīng)口途徑給藥，而研究也發(fā)現(xiàn)腹腔注射米諾環(huán)素會(huì)導(dǎo)致藥物延遲吸收及腹膜激惹[8]，而急性心肌保護(hù)中靜脈給藥途徑更能快速達(dá)到有效血藥濃度進(jìn)而滲透心肌發(fā)揮作用。因此，本研究通過與PARP抑制劑3-AB對(duì)比，選擇與米諾環(huán)素臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)劑量200 mg相當(dāng)?shù)慕o藥劑量3 mg/kg[8]，再灌注前10 min經(jīng)靜脈注射給藥，結(jié)果顯示，低劑量米諾環(huán)素后處理能明顯改善心肌損傷，表現(xiàn)為顯著減少心肌梗死范圍，減低再灌注早期心肌細(xì)胞的凋亡，其心肌保護(hù)機(jī)制涉及對(duì)心肌和循環(huán)PARP-1活性的抑制及對(duì)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，即通過抑制再灌注心肌內(nèi)PARP-1過度活化，減少循環(huán)白細(xì)胞內(nèi)PAR表達(dá)，進(jìn)一步減少血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β的含量，減輕系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，同時(shí)也證實(shí)低劑量米諾環(huán)素足以抑制心臟PARP-1的過度活化，高劑量米諾環(huán)素的心肌保護(hù)作用優(yōu)于PARP-1抑制劑3-AB。以上結(jié)果提示米諾環(huán)素可能作為一種PARP抑制劑安全地應(yīng)用于臨床急性心肌缺血的保護(hù)，而外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP的過度活化程度可能作為PARP抑制劑藥效學(xué)監(jiān)測的標(biāo)記物。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury[J]. N Engl J Med, 2007, 357(11):1121-1135.

[2]Dominguez-Rodriguez A, Abreu-Gonzalez P, Reiter RJ. Cardioprotection and pharmacological therapies in acute myocardial infarction: Challenges in the current era[J]. World J Cardiol, 2014, 6(3):100-106.

[3]Pacher P, Szabó C. Role of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) in cardiovascular diseases: the therapeutic potential of PARP inhibitors[J]. Cardiovasc Drug Rev, 2007, 25(3):235-260.

[4]Murthy KG, Xiao CY, Mabley JG, et al. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase in circulating leukocytes during myocardial infarction[J]. Shock, 2004, 21(3):230-234.

[5]Tóth-Zsámboki E, Horváth E, Vargova K, et al. Activation of poly(ADP-ribose) polymerase by myocardial ischemia and coronary reperfusion in human circulating leukocytes[J]. Mol Med, 2006, 12(9-10):221-228.

[6]Szabo C, Pacher P, Swanson RA. Novel modulators of poly(ADP-ribose) polymerase[J]. Trends Pharmacol Sci, 2006, 27(12):626-630.

[7]Tao R, Kim SH, Honbo N, et al. Minocycline protects cardiac myocytes against simulated ischemia-reperfusion injury by inhibiting poly(ADP-ribose) polymerase-1[J]. Cardiovasc Pharmacol, 2010, 56(6): 659-668.

[8]Bahrami F, Morris DL, Pourgholami MH. Tetracyclines: drugs with huge therapeutic potential[J]. Mini Rev Med Chem, 2012,12(1):44-52.

[9]鄭耀富，殷然，王夢洪，等. 肝X受體通過調(diào)控GLUT-4減輕心肌缺血/再灌注損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(1):18-24.

[10]Frank A, Bonney M, Bonney S, et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: from basic science to clinical bedside[J]. Semin Cardiothorac Vasc Anesth, 2012, 16(3):123-132.

[11]Sodhi RK, Singh N, Jaggi AS. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and its therapeutic implications[J]. Vascul Pharmacol, 2010, 53(3-4):77-87.

[12]Szabó G, Liaudet L, Hagl S, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase activation in the reperfused myocardium[J]. Cardiovasc Res, 2004, 61(3):471-480.

[13]Zingarelli B, Cuzzocrea S, Zsengellér Z, et al. Protection against myocardial ischemia and reperfusion injury by 3-aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase[J]. Cardiovasc Res, 1997, 36(2):205-215.

[14]Ikai K, Ueda K, Hayaishi O. Immunohistochemical demonstration of poly(adenosine diphosphate-ribose) in nuclei of various rat tissues[J]. J Histochem Cytochem, 1980, 28(7):670-676.

[15]Morrow DA, Brickman CM, Murphy SA, et al. A rando-mized, placebo-controlled trial to evaluate the tolerability, safety, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of a potent inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase (INO-1001) in patients with ST-elevation myocardial infarction undergoing primary percutaneous coronary intervention: results of the TIMI 37 trial[J]. J Thromb Thrombolysis, 2009, 27(4):359-364.

[16]Aguilar-Quesada R, Munoz-Gamez JA, Martin-Oliva D, et al. Modulation of transcription by PARP-1: consequences in carcinogenesis and inflammation[J]. Curr Med Chem, 2007, 14(11):1179-1187.

[17]Zhang LQ, Qi GX, Jiang DM, et al.Increased poly(ADP-ribosyl)ation in peripheral leukocytes and the reperfused myocardium tissue of rats with ischemia/reperfusion injury: prevention by 3-aminobenzamide treatment[J]. Shock, 2012, 37(5):492-500.

[18]Li C, Yuan K, Schluesener H. Impact of minocycline on neurodegenerative diseases in rodents: a meta-analysis[J]. Rev Neurosci, 2013, 24(5):553-562.

[19]Xia D, Shen K, Zhong W, et al. Administration of minocycline ameliorates damage in a renal ischemia/reperfusion injury model[J]. Clin Invest Med, 2011, 34(2):E55-E63.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)