汪奇云，劉和錄，華建江，吳雄君，徐志康，劉 瓊

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518104)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其病死率在各種惡性腫瘤中居首[1]。肺癌的早期診斷及早期治療至關(guān)重要。因臨床新發(fā)病例中大多屬于晚期肺癌，所以如果能早期診斷對肺癌的治療和預(yù)后具有非常重要的意義。現(xiàn)有檢查手段如X光敏感性低，難實現(xiàn)早期診斷；支氣管鏡檢法對于中央型肺癌的診斷比較有效，但是其缺點是一種侵入性檢查手段；CT掃描為廣泛非侵入性檢查方法，但其不能高效區(qū)分良性病變及肺癌。目前臨床肺癌早期診斷上缺乏高特異度、高靈敏度的血清學(xué)檢查辦法，因此如果能尋求早期特異的診斷方法，對提高患者的生存率具有重要意義。本研究通過實時熒光定量PCR檢測比較早期肺癌患者和健康成人血漿中游離miR-142-5p的表達(dá)水平，從而探討其作為肺癌患者早期診斷指標(biāo)的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 在患者知情同意下，我們在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所收集標(biāo)本。挑選2014年4月～10月未經(jīng)治療且處于疾病I，II期的新發(fā)病例，經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的55例肺癌患者作為研究組(C)，其中I期患者25例、II期30例，年齡60.71±10.62；53例健康成人作為對照組(N)，年齡57.11±12.09。病人入選標(biāo)準(zhǔn)包括疾病局限于胸部，沒有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的證據(jù)。標(biāo)本采集前一年內(nèi)沒有外科手術(shù)史和放射治療史。案例跟蹤兩年。癌癥和非癌癥樣本根據(jù)年齡、性別匹配，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 ABI stepone plus熒光PCR儀購自美國ABI公司；MiScrip ReverseTranscription Kit試劑盒購自德國Qiagen公司；普通PCR儀(SLAN-96P)購自上海宏石。

1.3 實驗方法

1.3.1 血漿收集：用EDTA-K2抗凝管抽取靜脈血液5.0 ml并混勻抗凝，30 min內(nèi)于4℃，3 000 r/min離心10 min。上層血漿分裝至1.0 ml冷凍管，每管0.5 ml，置-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 miRNA提取：用miReasy Mini Kit試劑盒(Qiagen，德國)提取血漿中的miRNA。主要步驟如下：①向400 μl血漿中加入5倍體積的QIAzol試劑，室溫放置5 min；②加入等體積100%(v/v)氯仿，放置2～3min；③4℃，12 000 r/min離心15 min后將離心機調(diào)至室溫；④取上層水相300 μl，加入1.5倍體積100 g/dl乙醇，充分混勻；⑤將混合液依次轉(zhuǎn)移至RNeasy Mini spin column柱子中，12 000 r/min室溫下離心15 s，棄廢液；⑥加700 μl Buffer RWT，離心 (同上)，棄廢液；⑦加500 μl RPE，離心(同上)，棄廢液；⑧重復(fù)步驟⑦；⑨換新2 ml收集管，空轉(zhuǎn)2 min；用30 μl的RNease-free water溶解RNA。置于-70℃低溫冰箱備用。為將RNA提取效率及PCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，在每個提取標(biāo)本中加入25 fmol的合成線蟲miR-54(Cel-miR-54)。

1.3.3 RT-qPCR體系建立：應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒(Qiagen，德國)于普通PCR儀上進行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計特異性引物：采用Primer5.0軟件設(shè)計，Cel-miR-54作為內(nèi)參照，引物序列為TACCCGTAATCTTCATAATCCGAG，miR-142-5p引物序列為CATAAAGTAGAAAGCACTACT。由于血漿中miRNA的濃度較低，按照試劑盒說明書，取15 μl模板RNA+4 μl Buffer RT+1 μl Mix，反應(yīng)體系為20 μl，反應(yīng)條件為：37℃1 h，95℃5 min。qPCR反應(yīng)采用miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，按照試劑盒說明書依次加入反應(yīng)所需的cDNA模板和試劑：①1 μl cDNA+0.4 μl miRNA特異性引物+10 μl Mix+2 μl UP+6.6 μl H2O；②1 μl cDNA+0.4 μl U6 F/R+10 μl Mix+8.2 μl H2O。反應(yīng)體系均為20 μl。反應(yīng)條件為：95℃15 min，94℃30 s，55℃15 s，70℃30 s，設(shè)置2個重復(fù)孔，40個循環(huán)結(jié)束。反應(yīng)在qPCR儀上進行(ABI step one plus)。

1.3.4 分析RT-qPCR數(shù)據(jù)：應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測肺癌血漿中游離miR-142-5p的表達(dá)水平。miR-142-5p為目的基因，Cel-miR-54作為內(nèi)參基因作數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。肺癌樣本作為研究組C，健康成人作為對照組N。目的基因的相對表達(dá)量(Re)應(yīng)用2-△Ct公式進行計算，ΔCtc=Ctc目-Ctc內(nèi)，ΔCtn=Ctn目-Ctn內(nèi)，ΔCt值越小，表示基因相對表達(dá)量越高，對目的基因的相對表達(dá)量進行對數(shù)處理后，符合正態(tài)分布規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者與健康成人血漿中miR-142-5p結(jié)果比較 miR-142-5p在肺癌患者組的相對表達(dá)量為8.878 2±2.251 2，健康成人組相對表達(dá)量為12.000 0±3.694 4，肺癌組明顯高于健康成人組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.325，F(xiàn)=13.561，P=0.000，P<0.01)，同時測得FC值為8.704 7，數(shù)值>1，也表示miR-142-5p在肺癌組中高表達(dá)。

2.2 miR-142-5p在早期診斷肺癌的價值評估 為了更好地評價miR-142-5p在肺癌早期診斷的診斷價值，采用SPSS17.0軟件制作miR-142-5p的受試者ROC曲線圖，分析結(jié)果顯示，miR-142-5p診斷肺癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.749，95%置信區(qū)間為0.657～0.841，同時得到臨床診斷臨界值為10.050，靈敏度為66.0%，特異度為83.6%，見圖1。

圖1 miR-142-5p的ROC分析

3 討論

3.1 微小RNA(microRNA或miRNA)是一類長度為18～24個核糖核苷酸組成的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標(biāo)基因完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動，并參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病過程[2，3]。Mitchell等[4]研究證實，miRNAs在血清或血漿中非常穩(wěn)定，在高溫、驟冷，還有強酸、強堿條件下都不會被降解，特別是能夠抵抗RNA酶的降解，表明血清或血漿miRNAs可以作為足夠穩(wěn)定的生物標(biāo)記物來應(yīng)用于臨床。近年來miRNA在腫瘤的診斷上價值也越來越受重視，Chen等[5]采用Solexa測序法對健康人血清、非小細(xì)胞肺癌血清的miRNA進行測序分析，結(jié)果顯示，肺癌患者血清miRNA分子譜與健康對照者明顯不同。miRNA還被發(fā)現(xiàn)可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進程相關(guān)的標(biāo)記物，有助于肺癌的早期診斷和個性化治療[6]。有研究發(fā)現(xiàn)在某些常見腫瘤如膀胱癌[7]、食管鱗狀細(xì)胞癌[8]等某些miRNA存在異常表達(dá)。miRNA已經(jīng)成為現(xiàn)代腫瘤學(xué)的研究熱點，為腫瘤的早期診斷、治療、預(yù)后提供了可靠的依據(jù)和新的方向。

3.2 miR-142位于人類17號染色體上，其含有兩個亞單位：miR-142-3p和miR-142-5p，分別為前體的3’端和5’端加工而來。有研究[9，10]發(fā)現(xiàn)， miR-142-5p在腎癌組織中表達(dá)量明顯高于癌旁組織，在特應(yīng)性皮炎患者外周血單個核細(xì)胞中存在高表達(dá)。但關(guān)于miR-142-5p與肺癌關(guān)系的相關(guān)文獻報道較少，為探討miR-142-5p與肺癌關(guān)系我們采用RT-qPCR檢測肺癌及健康成人血漿中的miR-142-5p表達(dá)水平。RT-qPCR經(jīng)證實為檢測miRNA最常用且有效的方法[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-142-5p在肺癌組的相對表達(dá)量明顯高過健康成人組(P<0.01)，提示miR-142-5p可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

3.3 ROC曲線是腫瘤標(biāo)志物臨床應(yīng)用中一種全面、準(zhǔn)確評價診斷實驗的非常有效的方法。面積在0.5以下時無診斷價值；面積在0.5～0.7時有較低的準(zhǔn)確性；面積在0.7～0.9時有較高的準(zhǔn)確性；面積在0.9以上時準(zhǔn)確性最高。我們通過ROC曲線對miR-142-5p對肺癌的診斷價值進行分析評價，發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積為0.749，由此可見，miR-142-5p對早期肺癌有一定的診斷價值。miR-142-5p診斷肺癌的特異度較高但敏感度不夠，可作為排除指標(biāo)。由于尚無法進行大樣本研究，所以miR-142-5p診斷早期肺癌的特異度、靈敏度、準(zhǔn)確度以及建立正常人群參考范圍等問題尚需進一步研究。可以預(yù)見，隨著臨床相關(guān)研究的開展，miR-142-5p作為肺癌的早期診斷指標(biāo)將有更廣闊的應(yīng)用前景。

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