黃芪注射液影響人惡性黑色素瘤細胞凋亡的實驗研究

王儉，胡溪恬，劉巧，楊穎，楊愷瑞,胡秀華*

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

摘要：目的探討黃芪注射液在體外對人惡性黑色素瘤A375細胞凋亡的影響。方法應用DAPI熒光染色觀察黃芪注射液作用后A375細胞凋亡情況，設對照組；流式細胞儀檢測黃芪注射液對A375細胞凋亡率的影響；分光光度法檢測黃芪注射液作用后A375細胞中caspase-3蛋白活性情況。結果與對照組相比，黃芪注射液處理組熒光顯微鏡下可以見到明顯的凋亡小體，且呈時間和質量濃度依賴；同時發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可使A375細胞凋亡率明顯升高，并呈濃度依賴性；caspase-3蛋白活性檢測發(fā)現(xiàn),100,200 mg/mL的黃芪注射液不影響Caspase-3的活性，300，400 mg/mL的黃芪注射液降低Caspase-3的活性。結論黃芪注射液有誘導人惡性黑色素瘤細胞A375細胞凋亡的作用，其誘導黑色素瘤凋亡是通過影響Caspase-3蛋白非依賴性途徑實現(xiàn)的。

關鍵詞：黃芪注射液；惡性黑色素瘤細胞；細胞凋亡；Caspase-3

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.04.030

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)04-0407-03

基金項目:國家自然

作者簡介:王儉(1991-)，男，碩士研究生，主要從事中醫(yī)臨床，腫瘤學研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-05-28)

*通信作者:胡秀華，電話-(010)64286976，電子信箱-xiuhuahu@126.com

Effects of Astragalus Injection on Human Melanoma A375 Cells Apoptosis

WANG Jian,HU Xitian,LIU Qiao,YANG Ying,YANG Kairui,HU Xiuhua*

(Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Astragalus injection on apoptosis and apoptotic factors of human melanoma A375 cells in vitro.MethodsDAPI stain method and flow cytometry were applied to observe apoptotic body and apoptotic ratio of A375 cell.Spectrophotography was used to examine the activity of caspase-3.ResultsCompared with the control group,the typical apoptotic bodies were observed under the fluorescence microscope in a time and concentration-dependent manner.The apoptotic ratio were obviously increased by Astragalus injection in a concentration-dependent manner.Moreover,we found activity of caspase-3 in Astragalus injecton with 100 and 200 mg/mL doses was no influence,in A375 cells treated by Astragalus injection with 300 and 400 mg/mL doses was lower than control and other doses.ConclusionApoptosis of A375 cells could be induced by Astragalus injection in a Caspase-3 activity-independent pathway.

Keywords:astragalus injection;human melanoma A375 cells;Cell apoptosis;Caspase-3

黃芪具有“補氣健脾，升陽舉陷，益衛(wèi)固表，利尿消腫，托毒生肌”作用[1]。其主要成分為黃芪多糖、黃芪皂甙、葡萄糖醛酸，并含有多種微量元素，可用于腫瘤的治療[2-4]。黃芪注射液是從黃芪中提取的有效成分精制而成，作為提高人體免疫力的藥物，已得到廣泛運用。本研究采用黃芪注射液為研究用藥，探討其對人惡性黑色素瘤A-375細胞凋亡的影響。

1實驗材料

黃芪注射液，購自中神威藥業(yè)有限公司，每毫升含生藥2 g。實驗時，取黃芪注射液適量，加入培養(yǎng)基相應量，將黃芪注射液無菌配制至終濃度為100，200，300，400 mg/mL。人惡性黑色素瘤A-375細胞株，購于中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心。將A-375細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用新鮮配制的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d傳代1次。DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、及胎牛血清(Hyclone公司，美國)，碘化丙啶PI(Sigma，美國)，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染液(DAPI,Sigma，美國)，RNA酶(Sigma，美國)，BCA法蛋白定量試劑盒(普利萊公司，中國)，Caspase-3分光光度法檢測試劑盒(南京凱基，中國)。CO2培養(yǎng)箱(BINDER)，酶標儀(Bio-Tek，美國),流式細胞儀(BD，美國)，熒光顯微鏡(OLYMPUS)。

2實驗方法

2.1熒光顯微鏡觀察A-375細胞的凋亡情況將A-375細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中用新鮮配制含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞,以1×104個/mL濃度接種于24孔板，待細胞貼壁24 h后吸除原培養(yǎng)液，實驗組每孔分別加入500 μL含不同濃度的黃芪注射液，終濃度分別為100，200，300 mg/mL，每組設3個復孔；對照組加入等量的生理鹽水，設3個復孔，分別培養(yǎng)48 h,72 h后吸除原培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗2遍,加入用生理鹽水配成的1 μg/mL的DAPI染液，進行DAPI染色，常溫避光作用5 min,用PBS洗2遍后置熒光顯微鏡下觀察A-375細胞及細胞核的形態(tài)并拍照。

2.2流式細胞術檢測A-375細胞的凋亡率將A-375細胞接種于培養(yǎng)瓶中,待80%細胞匯合成片后，分別吸除原培養(yǎng)液，實驗組加入不同濃度的黃芪注射液，終濃度分別為200，300，400 mg/mL；對照組加入等量生理鹽水，48 h后收集細胞，冷PBS洗滌細胞(1 000 r/min，5 min)，加入1 mL 4 ℃、75%乙醇，輕輕吹打混勻后于4 ℃過夜，離心3 min(1 000 r/min)，吸除上清，再加入1 mL 4 ℃生理鹽水重懸細胞，離心3 min(1 000 r/min),吸除上清，加入50 μg/mL的PI、50 μg/mL的RNA酶1:1混合液1 mL，避光10 min后上機檢測分析細胞的凋亡率。

2.3Caspase-3活化程度測定收集實驗組(用終濃度分別為100，200，300，400 mg/mL的黃芪注射液處理)和對照組的細胞，用PBS洗滌2次，離心(2 000 r/min,5 min)，盡量吸除PBS上清。在收集的沉淀中分別加入100∶1的LysisBuffer與DTT混合液100 μL，在冰上裂解1 h，其間斡旋震蕩4次，每次10 s，后離心(4 ℃，10 000 r/min，1 min)，吸取上清即樣品備用。按照BCA試劑盒說明書配工作液和標準品①～⑧，分別?、佟鄻藴势?5 μL與200 μLWR混合，加入96孔板中，再取樣品25 μL分別與200 μLWR混合，加入96孔板中，上述96孔板置于37 ℃反應30 min，在562 nm測定其吸光值。根據(jù)檢測結果計算出樣品的蛋白濃度，吸取100 μL含100～200 μg蛋白的樣品，加入100∶1的2× Reaction Buffer和DTT混合液100 μL，再加入10 μL Caspase-3 Substrate 并于37 ℃避光孵育4 h，405 nm波長處測定其吸光值。

3實驗結果

3.1DAPI染色后觀察黃芪注射液對A-375細胞核的影響利用DAPI染色后，熒光顯微鏡觀察結果如圖1所示,對照組細胞核染色均勻一致，形狀規(guī)則，細胞核膜光滑清晰。不同濃度的黃芪注射液處理的實驗組可見細胞核的不同改變，其中100 mg/mL黃芪注射液處理72 h后可見核濃縮，染色較深，核膜不規(guī)則；300 mg/mL黃芪注射液處理48 h和200 mg/mL黃芪注射液處理72 h后均可發(fā)現(xiàn)除核濃縮，染色較深，熒光增強，有些核碎裂成大小不等的碎片，形成凋亡小體(如圖1箭頭所示)；300 mg/mL黃芪注射液處理72 h后，所有細胞核都碎裂成大小不等的碎片，即形成典型的凋亡小體，細胞質明顯濃縮，細胞變小，無典型的細胞形態(tài)。隨著黃芪注射液處理的濃度和時間的增加，核濃縮程度增加，細胞凋亡程度加大。

注：箭頭所指為熒光小體 　　圖1　黃芪注射液不同時間濃度對A375細胞凋亡的影響(DAPI染色×400)

3.2流式細胞術檢測黃芪注射液對A-375細胞凋亡的影響利用200，300，400 mg/mL黃芪注射液處理48 h后，流式細胞術分析A-375細胞凋亡率，結果如圖2所示，自200 mg/mL黃芪注射液實驗組開始，在細胞周期圖G0期出現(xiàn)亞二倍峰，即圖2中箭頭所指的區(qū)域,且隨著黃芪注射液的濃度增加亞二倍峰值增加。同時，發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡率隨黃芪注射液濃度升高而增大，對照組及實驗組(200，300，400 mg/mL黃芪注射液處理)的A-375細胞凋亡率分別為0.08%，1.10%，2.04%，14.06%。

3.3黃芪注射液對A-375細胞中Caspase-3活化的調節(jié)用100，200，300，400 mg/mL黃芪注射液處理A-375細胞24 h后，經過蛋白定量，在相同蛋白濃度下進行Caspase-3活性測定，結果如圖3所示，終濃度為100，200 mg/mL黃芪注射液處理的實驗組的OD值和對照組無明顯差異，提示這兩組濃度不能使Caspase-3活化；利用300,400 mg/mL黃芪注射液處理的實驗組的Caspase-3活化程度明顯降低。

圖2　不同濃度黃芪注射液處理A-375細胞48 h后流式細胞儀分析結果

圖3　黃芪注射液對A-375細胞caspase-3活性的影響

4討論

惡性黑色素瘤是一類起源于神經嵴的黑色素細胞惡性腫瘤。其發(fā)病率為全身惡性腫瘤的1%～2%[5]，其惡性程度高，預后差[6]。近10年來，黑色素瘤發(fā)病率持續(xù)上升，應引起足夠的重視[7]。

臨床上多用黃芪配伍其他中藥來改善癌癥中、晚期患者的生活質量[8-9]。同時黃芪對多種腫瘤細胞也具有抑制作用[10-11]。黃芪還對化療有著增效減毒的作用[12-14]。本實驗利用DAPI熒光染色后，觀察A-375細胞及細胞核的形態(tài)，結果顯示，經過黃芪注射液處理過的細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡小體[7,15]；流式細胞分析結果表明，隨著藥物濃度的升高，A-375細胞的凋亡率隨之升高，且呈時效-量效關系，這和DAPI熒光染色的結果一致。本實驗證明黃芪注射液可以誘導A-375細胞凋亡，抑制黑色素瘤細胞的增殖。但值得探討的是，Caspases-3是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個重要共同點是其活化后可以特異地斷開靶蛋白的天冬氨酸殘基后的肽鍵，促使細胞凋亡[16]。雖然導致細胞凋亡最主要的途徑之一即是Caspase依賴的信號通路，但目前發(fā)現(xiàn)凋亡誘導因子(Apoptosis-inducing factor，AIF)能夠轉位到細胞核，切斷染色體DNA，從而通過Caspase非依賴的信號途徑誘導凋亡[17]。而我們實驗過程中發(fā)現(xiàn)黃芪注射液并不增加Caspases-3的活性，而且高濃度的黃芪注射液還降低了Caspase-3的活性；而DAPi染色熒光顯微鏡及細胞周期檢測結果都證明黃芪注射液可以有效地促進人惡性黑色素瘤A-375細胞的凋亡。基于此，我們分析黃芪注射液誘導A-375細胞凋亡是通過不依賴caspase-3活性的途徑起作用的，其具體作用機制還需要進一步研究。

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