■陳飛暴 寧司濱 姜晨

（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023）

隨著現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)飼料工業(yè)的發(fā)展，人們對魚類的營養(yǎng)需要及其飼料配方進(jìn)行了許多研究。同時(shí)，魚類飼料與消化酶之間的關(guān)系也引起了魚類生物學(xué)家的關(guān)注。魚類消化酶活性的高低直接關(guān)系到魚類對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而影響到魚類的生長和發(fā)育。

鑒于大瀧六線魚具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的開發(fā)前景，而目前對其消化酶活性方面的研究較少，特別是酸堿度對消化酶活性的影響還未見報(bào)道。本文設(shè)置了10個(gè)pH值梯度，以研究不同pH值對大瀧六線魚不同組織（胃、盲囊、前腸、后腸、肝胰臟）的主要消化酶（蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影響，為大瀧六線魚人工餌料中添加促進(jìn)胃液分泌的添加劑的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的大瀧六線魚捕自大連海區(qū)，共120尾，大小基本一致，無病無傷，體質(zhì)健康。魚體重120～145 g。取樣前先將試驗(yàn)魚饑餓24 h，解剖過程在冰盤上進(jìn)行，取出胃、盲囊、肝胰臟、前腸和后腸并剝除多余脂肪和組織，用精密pH試紙測定各組織的酸堿度。測定結(jié)束后，用去離子水清洗組織內(nèi)容物并用濾紙吸干水分，然后稱重記錄。之后將組織剪碎進(jìn)行勻漿，再將勻漿液在4℃冰箱內(nèi)靜置1 h，然后用冷凍離心機(jī)離心20 min，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，取上清液于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)為測定pH值對大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的主要消化酶活性（包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶）的影響，共設(shè)計(jì)了10個(gè)不同的pH值梯度值，每個(gè)pH值設(shè)置3個(gè)重復(fù)。胃蛋白酶pH值設(shè)定范圍是2.0～7.4，每兩個(gè)pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟蛋白酶的pH值設(shè)定范圍是6.4～10.0，每兩個(gè)pH值差值為0.4。胃淀粉酶pH值設(shè)定范圍是2.2～7.6，每兩個(gè)pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟淀粉酶的pH值設(shè)定范圍是5.2～8.8，每兩個(gè)pH值差值為0.4。胃脂肪酶pH值設(shè)定范圍是2.6～8.0，每兩個(gè)pH值差值為0.6；盲囊、前腸、后腸及肝胰臟脂肪酶的pH值設(shè)定范圍是6.4～10.0，每兩個(gè)pH值差值為0.4。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

蛋白酶活性測定采用福林-酚法。蛋白酶的定義為：在37℃下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個(gè)酶活力單位。蛋白酶活力單位=A/15×F；其中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線下，樣品測得的光密度所對應(yīng)的酪氨酸微克數(shù)；F為酶液的最終稀釋倍數(shù)；反應(yīng)時(shí)間15 min。

淀粉酶活性測定采用淀粉-碘顯色法。淀粉酶定義為：在37℃下，30 min內(nèi)，100 ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg時(shí)稱為一個(gè)淀粉酶單位。淀粉酶活力單位/100 ml=（對照管光密度-測定管光密度）/對照管光密度×800。

脂肪酶活性測定采用滴定法，以聚乙烯醇（P.V P.）橄欖油乳化液為反應(yīng)底物。脂肪酶的定義為：在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μg分子脂肪酸的酶量定為一個(gè)國際單位。脂肪酶活力單位=（A-B）N·f/t，其中A為樣品消耗堿液的體積數(shù)（ml），B為對照組消耗堿液的體積數(shù)（ml），N為每毫升堿液微克分子數(shù)，f為稀釋倍數(shù)，t為作用時(shí)間（min）。

蛋白質(zhì)濃度的測定采用考馬司亮藍(lán)結(jié)合法，牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

比活力定義為：每毫克（克）酶蛋白含多少酶活力單位。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理分析，并用Duncan's法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用“Mean±SE”的形式表示。使用Excel2003軟件進(jìn)行圖表制作。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同pH值對大瀧六線魚蛋白酶比活力的影響（見表1）

表1 不同pH值對大瀧六線魚蛋白酶比活力的影響（U/mg）

大瀧六線魚不同組織的蛋白酶比活力都隨著pH值的增加呈先升高后降低的趨勢。胃蛋白酶在pH值為2.6時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于其它pH值對應(yīng)的胃蛋白酶活性（P＜0.05）；盲囊蛋白酶在pH值為8.8時(shí)活性最強(qiáng)，但與其它pH值對應(yīng)的盲囊蛋白酶活性相比較并無顯著性差異（P＞0.05）；前腸蛋白酶在pH值為8.4時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于pH為6.4和pH值為10.0時(shí)的前腸蛋白酶活性（P＜0.05）；后腸蛋白酶在pH值為8.8時(shí)活性最強(qiáng)，但只對pH值為6.4的后腸蛋白酶表現(xiàn)出顯著性差異，對于其它pH值對應(yīng)的后腸蛋白酶活性并不表現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）；肝胰臟蛋白酶在pH值為7.6時(shí)酶比活力最高，與其它pH值條件下對應(yīng)的肝胰臟蛋白酶活性差異不顯著（P＞0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的蛋白酶比活力最適pH值分別為2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最適pH值條件下，蛋白酶比活力的排序?yàn)椋何福久つ遥靖我扰K＞前腸＞后腸。

2.2 不同pH值對大瀧六線魚淀粉酶比活力的影響（見表2）

表2 不同pH值對大瀧六線魚淀粉酶比活力的影響（U/g）

大瀧六線魚各組織的淀粉酶活性均隨pH值的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這一趨勢與蛋白酶相似。胃淀粉酶在pH值為5.8時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于其他pH值對應(yīng)的淀粉酶活性（P＜0.05）。盲囊淀粉酶在pH值為7.6時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于除pH值為8.0之外的其它各組的淀粉酶活性（P＜0.05）。前腸淀粉酶在pH值為8.4時(shí)活性最強(qiáng)，與其它pH值相對應(yīng)的前腸淀粉酶活性相比較，呈顯著性差異（P＜0.05）。后腸淀粉酶與前腸淀粉酶相似，都表現(xiàn)在pH值為8.4時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于其它各pH值條件下的后腸淀粉酶活性（P＜0.05）。肝胰臟淀粉酶在pH值為8.0時(shí)活性最強(qiáng)，與其它pH值條件下對應(yīng)的肝胰臟淀粉酶活性相比較，表現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的淀粉酶活性最適pH值分別為5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。在最適pH值條件下，淀粉酶活性的排序?yàn)椋好つ遥疚福厩澳c＞后腸＞肝胰臟，但各組織之間淀粉酶活性的差異并不顯著。

2.3 不同pH值對大瀧六線魚脂肪酶比活力的影響（見表3）

大瀧六線魚各試驗(yàn)組織的脂肪酶活性隨pH值的增高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與蛋白酶和脂肪酶的測定結(jié)果相似。胃脂肪酶在pH值為7.4時(shí)活性最強(qiáng)，且顯著高于其它各pH值條件下的胃脂肪酶活性（P＜0.05）。盲囊脂肪酶在pH值為8.0時(shí)酶活性最強(qiáng)，相比于其他各pH值條件下的盲囊脂肪酶有顯著性差異（P＜0.05）。前腸脂肪酶在pH值為8.4時(shí)酶活性最強(qiáng)，且與其它各pH值條件下的前腸脂肪酶活性相比，差異顯著（P＜0.05）。后腸脂肪酶也表現(xiàn)在pH值為8.4時(shí)酶活性最強(qiáng)，且顯著高于除pH值為8.0之外的其它各pH值條件下的后腸脂肪酶活性 （P＜0.05）。肝胰臟脂肪酶在pH值為7.6時(shí)活性最強(qiáng)，且與pH值在6.8～8.0之間的各組酶比活力差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于其它各pH值梯度下的肝胰臟脂肪酶活性（P＜0.05）。由此，大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的脂肪酶比活力最適pH值分別為7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最適pH值條件下，脂肪酶活性排序?yàn)椋好つ遥靖我扰K＞前腸＞后腸＞胃。

表3 不同pH值對大瀧六線魚脂肪酶比活力的影響（U/mg）

3 討論

3.1 食性與消化酶

魚類的食性與消化酶之間關(guān)系密切。Agrawal等（1975）[1]比較了不同食性魚類的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的差異，在肉食性、雜食性和草食性魚類中，肉食性魚的蛋白酶和脂肪酶活性相對較高，而草食性魚類的淀粉酶活性較高，雜食性魚類的消化酶活性則介于二者之間。吳婷婷等（1994）[2]在對鱖、鯉、鰱、鯽、青魚和草魚的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了這一相關(guān)性，蛋白酶的活性在不同食性的魚類中存在差異，在肉食性魚類、雜食性魚類、濾食性魚類和草食性魚類中表現(xiàn)為活性逐漸降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，在適宜的pH值條件下，大瀧六線魚的淀粉酶活性較弱，脂肪酶活性次之，蛋白酶活性最高。這一結(jié)果恰與其食性相吻合，大瀧六線魚屬近海底棲肉食性魚類，主食魚類、甲殼類和多毛類等底棲動物，這也進(jìn)一步說明了食性與消化酶之間相一致的觀點(diǎn)。不同食性的魚類之所以表現(xiàn)出不同的消化酶活性，主要是因?yàn)橄课坏慕Y(jié)構(gòu)的不同，不同組織結(jié)構(gòu)具有不同的消化機(jī)能，從而引起消化酶的活性具有明顯的差異。肉食性魚類多以高蛋白含量的水生動物為食，且腸道較短，需要具有較高的蛋白酶活性才能在有效的時(shí)間內(nèi)使食物得到充分消化，而草食性魚類腸道較長，食物在消化道內(nèi)停留時(shí)間長，可以彌補(bǔ)蛋白酶活性低的不足，這也是魚類對其生態(tài)環(huán)境的一種適應(yīng)性表現(xiàn)。

3.2 pH值對消化酶活性的影響

從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，大瀧六線魚的各組織的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均隨著pH值的增加，表現(xiàn)為先升高再降低。消化酶活性之所以會隨著反應(yīng)pH值的不同而發(fā)生改變，其一是pH值能使消化酶的活性中心或與之相關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響底物與消化酶的結(jié)合，改變消化酶的活性；其二是當(dāng)pH值超過一定范圍時(shí)，會使消化酶的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致消化酶變性失活（姜令緒等，2007）[3]。

3.2.1 pH值對魚類蛋白酶活性的影響

本研究表明大瀧六線魚胃、盲囊、前腸、后腸和肝胰臟的蛋白酶活性隨著pH值的變化，其活性均發(fā)生變化，并在一定的pH值下達(dá)到最大值，即各類消化酶均存在著適宜的pH值，而且不同消化部位的蛋白酶，其適宜的pH值水平不同。在實(shí)驗(yàn)中，胃、盲囊、前腸、后腸和肝胰臟的蛋白酶比活力最適pH值分別為2.6、8.8、8.4、8.8、7.6。在最適pH值條件下，胃和盲囊的蛋白酶比活力明顯高于其他組織，因此可以認(rèn)為大瀧六線魚的胃和盲囊為消化蛋白質(zhì)的主要部位。

周景祥等（2001）[4]研究指出，有胃硬骨魚類胃蛋白酶的最適pH值在2.0～3.0之間，腸道蛋白酶的最適pH值在6.5～9.5之間，肝胰臟蛋白酶的最適pH值在7.0～8.7；李文雯等（2012）[5]報(bào)道星突江鰈胃、腸和肝胰腺蛋白酶活性的最適pH值分別為3.8、8.2和7.8；范鎮(zhèn)明等（2008）[6]研究結(jié)果表明，河鱸胃、腸和肝胰臟的蛋白酶最適pH值分別為2.0、8.0和6.0；區(qū)又君等（2010）[7]研究發(fā)現(xiàn)卵形鯧鲹幼魚的胃蛋白酶最適pH值為2.2，成魚為3.2，幼魚的肝、腸和幽門盲囊的蛋白酶活性最適pH值為7.2，而成魚為8.0；沈文英等（2006）[8]報(bào)道澳洲寶石魚腸道、肝胰臟蛋白酶的最適pH值分別為7.0～7.5、7.5，胃蛋白酶的最適pH值為2.0。還有一些關(guān)于魚類腸道蛋白酶的最適pH值的報(bào)道，如黃鱔的適宜pH 值為 8.0～9.5（楊代勤等，2005）[9]，鮭魚（Salmo salar）為 9.2（W.Uys等，1987）[10]，大菱鲆（ScopHthalmus maximus）為 9.0（Munilla-Moran R 等，1996）[11]，以上的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果較為一致，即胃蛋白酶的最適pH值在酸性范圍，消化道其它部位的蛋白酶最適pH值均在中性至偏堿性范圍。

另有文獻(xiàn)認(rèn)為，有胃魚類胃蛋白酶在強(qiáng)酸性條件下活性較強(qiáng)，在中性環(huán)境（pH值7.0）則失活（區(qū)又君等，2010；尾崎久雄，1983）[12-13]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)pH值升至7.4時(shí)，胃蛋白酶活性接近零，認(rèn)為基本失活，這與上述觀點(diǎn)一致?？梢哉J(rèn)為胃進(jìn)行的蛋白消化是在酸性條件下進(jìn)行的，在中性至堿性條件下不具備消化蛋白的能力。

3.2.2 pH值對魚類淀粉酶活性的影響

大瀧六線魚消化道各部位淀粉酶活性隨著pH值的升高，呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟的淀粉酶比活力最適pH值分別為5.8、7.6、8.4、8.4、8.0。其中胃最適pH值偏酸性，其它部位偏堿性。在最適pH值條件下，各組織的淀粉酶的酶比活力差異較小，認(rèn)為大瀧六線魚各消化器官均具備一定的淀粉消化能力。

關(guān)于魚類淀粉酶的最適pH值研究，國內(nèi)外有很多報(bào)道。周景祥等（2001）[4]報(bào)道了有胃硬骨魚類肝胰臟、腸和胃淀粉酶的最適pH值分別是6.8～7.0、5.0～8.0和5.0～7.0；梅景良等（2004）[14]報(bào)道了黑鯛胃、肝胰臟和腸淀粉酶的最適pH值分別是5.0、7.0和7.0；沈文英等（2006）[8]報(bào)道了澳洲寶石魚肝胰臟、腸道、胃淀粉酶的最適pH值均為6.2；尾崎久雄（1983）[13]報(bào)道了狹鱈（Theragra chalcogramma）幽門盲囊和腸的淀粉酶最適pH值為7.0；李文雯等（2012）[5]報(bào)道星突江鰈胃、腸和肝胰腺淀粉酶活性的最適pH值分別為6.6、7.4和7.0；楊代勤等（2005）[9]報(bào)道了黃鱔腸道淀粉酶的適宜pH值為7.0～8.0；陳健等（2015）[15]研究結(jié)果表明不同日齡的藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚淀粉酶最適pH值不同，1日齡仔魚淀粉酶最適pH值為7,7日齡仔魚pH值為7～7.5，15日齡仔魚 pH值為 7.5；楊元昊等（2006）[16]研究表明蘭州鲇的胃、肝胰臟和腸淀粉酶最適pH值分別為5.4、6.6和7.0；另有研究表明斑點(diǎn)叉尾鮰胃、腸和肝胰臟淀粉酶的最適pH值分別為5.5、7.5和6.5（宋威等，2010）[17]。以上各研究結(jié)果表明魚類消化道淀粉酶的最適pH值不盡相同，這可能是由于不同種類、不同消化部位酶活性中心存在差異，致使酶活力表達(dá)的最適pH值有所不同。但總的來說淀粉酶活性的最適pH值均控制在弱酸性到中性偏堿性范圍內(nèi)。

3.2.3 pH值對魚類脂肪酶活性的影響

大瀧六線魚消化道各部位脂肪酶活性隨著pH值的升高，均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，胃、盲囊、前腸、后腸及肝胰臟脂肪酶最適pH值分別為7.4、8.0、8.4、8.4、7.6。在最適pH值條件下，胃的脂肪酶活性最低，但盲囊的脂肪酶活性明顯高于其它組織?？梢哉J(rèn)為大瀧六線魚的盲囊是進(jìn)行脂肪消化的最主要場所，其它消化部位起到輔助消化脂肪的作用。范鎮(zhèn)明等（2008）[6]研究結(jié)果表明，河鱸胃、腸和肝胰臟的脂肪酶最適pH值分別為6.0、3.0和4.0；李文雯等（2012）[5]報(bào)道星突江鰈胃、腸和肝胰腺脂肪酶活性的最適pH值分別為 7.4、7.8 和 7.8；伍莉等（2002）[18]研究表明黃鱔前、中、后腸和肝胰臟中脂肪酶活力的最適pH值均為7.2，楊代勤等（2005）[9]對黃鱔的研究表明黃鱔脂肪酶的適宜pH值為7.0～7.5，二者相符。以上研究結(jié)果表明，胃脂肪酶最適pH值在偏酸或中性偏堿性范圍內(nèi)；腸等消化部位脂肪酶最適pH值一般在中性偏堿性范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大瀧六線魚消化道各部位脂肪酶的最適pH值均在弱堿性范圍，與上述結(jié)論基本一致。

3.3 消化道不同部位消化酶活性差異

在實(shí)驗(yàn)中，大瀧六線魚的消化道各部位的蛋白酶在最適pH值條件下，不同組織的蛋白酶活性的排序?yàn)椋何福久つ遥靖我扰K＞前腸＞后腸，由此可見，胃的蛋白酶活性最強(qiáng)，因此，可以認(rèn)為大瀧六線魚的胃是蛋白質(zhì)消化的最初也是最主要的場所，且實(shí)驗(yàn)中檢測到胃液在正常情況下呈酸性，極有利于其蛋白酶活性的發(fā)揮。而緊接著胃的消化部位的盲囊也具有較高的蛋白酶活性，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)一步消化，提高魚體消化吸收蛋白質(zhì)的能力。

在各部位淀粉酶的最適pH值條件下，淀粉酶活性排序?yàn)椋好つ遥疚福厩澳c＞后腸＞肝胰臟，但各組織之間淀粉酶活性差異不顯著（P＞0.05）。認(rèn)為大瀧六線魚各消化部位均具備一定的淀粉消化能力，但各部位淀粉酶比活力均不高，這是與其食性相適應(yīng)的表現(xiàn)。

在各部位脂肪酶的最適pH值條件下，脂肪酶活性的排序?yàn)椋好つ遥靖我扰K＞前腸＞后腸＞胃，盲囊的脂肪酶活性最強(qiáng)，可以認(rèn)為盲囊為大瀧六線魚進(jìn)行脂肪消化的主要部位。Das等（1991）[19]認(rèn)為，魚類肝胰臟是生成脂肪酶的主要部位,且消化系統(tǒng)的各個(gè)部分均存在脂肪酶的活動。在實(shí)驗(yàn)中測得的肝胰臟脂肪酶活性顯著低于盲囊，稍高于腸，可能是由于肝胰臟中的脂肪酶多是以無活性的酶原存在，所以檢測到的脂肪酶活性不太高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，大瀧六線魚幽門盲囊是進(jìn)行脂肪消化的最主要場所，其它消化部位起到輔助消化脂肪的作用，胃是消化脂肪水平最低的消化部位。

實(shí)驗(yàn)還檢測到盲囊、腸和肝胰臟中消化液均為中性偏弱堿性，且受消化道中食物有無的影響較小。而從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，大瀧六線魚上述各消化部位主要消化酶的最適pH值也在中性偏堿性范圍內(nèi)，認(rèn)為大瀧六線魚消化道pH值較有利于各部位消化酶活性的發(fā)揮，有效促進(jìn)對食物的消化和吸收。

另外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出，大瀧六線魚消化道的前段對食物的消化起主導(dǎo)作用，尤其是盲囊的消化能力不容忽視。對于蛋白質(zhì)的消化，胃最強(qiáng)，盲囊次之；對于脂肪的消化，盲囊的酶活性顯著高于其它部位；對于淀粉的消化，各部位差異不顯著，但盲囊的淀粉酶活性依然高于其它部位。可見，盲囊是大瀧六線魚消化的中樞部位。