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馬鈴薯苗期抗寒能力直接評價體系的建立與應(yīng)用

涂衛(wèi)，趙喜娟，寇爽，康黎，陳琳，宋波濤*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室/國家蔬菜改良中心華中分中心，湖北武漢430070 )

摘要：通過不同溫度處理馬鈴薯苗期植株，以評價葉片損傷程度為標(biāo)準(zhǔn)，建立馬鈴薯苗期抗寒能力的直接評價體系，并利用該評價體系和電解質(zhì)滲漏法，對40份馬鈴薯材料進行抗寒能力測定和相關(guān)分析。結(jié)果顯示，兩種方法間具有極顯著的直線相關(guān)關(guān)系（Y = 8.65 + 1.75X，r = 0.86, P < 0.01 ) ,說明苗期抗寒能力直接評價體系可準(zhǔn)確高效地評價馬鈴薯抗寒能力；同時也篩選獲得了21份具有較好抗寒能力的馬鈴薯材料，為后期馬鈴薯抗寒相關(guān)研究和抗寒育種提供了材料保障。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；抗寒能力；鑒定體系

低溫脅迫是限制馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）地理分布和產(chǎn)量擴大的重要影響因素之一[1]，霜凍傷害會導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，給馬鈴薯生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失。如秘魯及玻利維亞等高原地區(qū)的馬鈴薯生產(chǎn)，平均每三年就有約25%種植面積的馬鈴薯遭受-2℃的低溫霜凍危害[2]。中國馬鈴薯的四個主要種植區(qū)幾乎都會受到霜凍危害，在苗期易遭受倒春寒，成熟期則會遭受寒潮或早霜等。隨著中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和保障糧食安全的需要，南方冬閑田區(qū)馬鈴薯種植面積將進一步增加，但由于馬鈴薯普通栽培品種并不耐霜凍，嚴(yán)重影響了馬鈴薯在該區(qū)域的種植，阻礙著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

目前，馬鈴薯抗寒能力的鑒定方法主要有電解質(zhì)滲漏法[1,3]、田間自然霜凍法[4]、葉綠素?zé)晒夥治龇╗5,6]、形態(tài)學(xué)鑒定法[7,8]等，這些方法主要利用待測植株在低溫條件下的外部形態(tài)、特定的生理生化方面等變化綜合分析評價馬鈴薯的抗寒能力，其具有外部環(huán)境不易控制、測量成本較高、并不是抗寒能力直接評價指標(biāo)等問題，導(dǎo)致較難大規(guī)模用于評價和篩選抗寒材料。本研究以不同溫度處理下馬鈴薯葉片的受損傷程度為標(biāo)準(zhǔn)，建立了馬鈴薯苗期抗寒能力直接評價方法，并進行了驗證，為馬鈴薯抗寒材料的大規(guī)模篩選和抗寒能力的鑒定提供標(biāo)準(zhǔn)，從而為馬鈴薯抗寒育種提供種質(zhì)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

供試材料為來自12個野生種的28份野生材料和9份栽培種材料以及1個雜交組合的3個子代，共40份材料（表1）。

表1　試驗材料Table 1 Experiment materials

1.2方法

1.2.1材料種植

將生長4周左右的試管苗移栽到10 cm×10 cm的塑料缽中（栽培基質(zhì)為1 : 1的營養(yǎng)土和泥炭土），每份材料種植12缽，每缽2株，置于16 h光照/8 h黑暗、溫度為20℃/18℃、濕度85%、光強為400 μmol/m2·s的植物培養(yǎng)箱內(nèi)（Conviron，ATC26,加拿大）生長3~4周后用于苗期抗寒能力鑒定。相同條件下種植另外16缽用于抗寒性LT50測定。

1.2.2馬鈴薯苗期抗寒性直接鑒定方法

以實驗室前期篩選的抗寒基因型‘ACL-27’、敏感基因型‘10908-06’和中等抗性基因型‘PUR206-1’為試驗材料，對移栽后的試管苗長至3~5片展開葉時（3~4周）進行人工低溫處理。設(shè)置-1，-2，-3，-3.5和-4℃5個溫度對3個基因型的材料進行處理，試驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)包括4缽，其中3缽低溫處理，1缽為非處理作對照。鑒于部分抗寒性材料低溫處理后，雖表現(xiàn)出一定的凍傷癥狀，但常溫放置一段時間后，植株仍能恢復(fù)正常生長的現(xiàn)象，為避免低溫處理后立即評級帶來的試驗誤差，本試驗采用低溫處理后，將材料置于20℃下恢復(fù)生長24 h，根據(jù)恢復(fù)后的植株狀態(tài)進行低溫凍害損傷評級，評級標(biāo)準(zhǔn)參照Vega和Bamberg[4]的賦值標(biāo)準(zhǔn),以下面的凍傷級別評價植株的凍傷程度。0：沒有損傷；1：頂部葉片輕微傷害；2：少數(shù)頂部葉片凍死；3：大多數(shù)頂部葉片凍死；4：所有頂部葉片和葉柄凍死；5：所有葉片凍死；6：所有葉片及莖稈凍死。計算各試驗材料受損程度的傷害指數(shù)（DI）。DI =（X0 + X1 + X2 + X3 + X4 + X5 + X6）/總株數(shù)，式中X0~X6分別代表各損傷等級。

1.2.3馬鈴薯非馴化抗寒LT50測定

試驗采用Steffen等[3]的測定方法并略作修改，對試驗材料的離體葉片進行低溫處理，具體處理過程如下：取頂端充分展開葉片用蒸餾水多次沖洗并吸干葉片表面水分，將葉片放置在帶蓋的玻璃試管（直徑25 mm×150 mm）底部，葉面朝下，每管放1片葉，每個溫度點設(shè)置3次重復(fù)。將試管放入低溫水浴鍋（Huber，CC-K20，德國，液體媒介為體積比1?1的乙二醇和蒸餾水混合物）中。水浴鍋的初始溫度設(shè)為0℃，保持30 min，取出3管作為對照；降到-0.5℃，再保持30 min；降溫速率為-0.5℃/30 min。溫度從-0.5℃降到-1℃并保持30 min時，在每管中加入一小塊冰,再保持30 min后取樣；溫度從-1℃降到-1.5℃并持續(xù)1 h，然后降到-2℃并保持30 min后取樣。溫度從- 2℃降到-3℃，保持30 min后取樣，每次取3管；依次類推，降溫直到目標(biāo)溫度，并分別取樣。在每個溫度點到達后及時將樣品試管取出后放在冰上，于4℃的低溫室中解凍過夜后加入25 mL去離子水，以220 r/min的轉(zhuǎn)速在室溫下震蕩1 h。靜置后用電導(dǎo)儀（梅特勒，F(xiàn)E30-K，瑞士）分別測定對照的電導(dǎo)率R0和樣品的電導(dǎo)率R1；沸水浴30 min后測定樣品的總電導(dǎo)率R2，每個溫度點對應(yīng)的3次電解質(zhì)滲漏率（R1-R0/R2-R0）的平均值通過Logistic方程擬合，電解質(zhì)滲漏率達50%所對應(yīng)溫度為該材料的半致死溫度[9]。

1.3數(shù)據(jù)處理

抗寒LT50數(shù)值模擬采用GraphPad Prism Version 3.02軟件，聚類分析采用統(tǒng)計軟件SPSS（IBM SPSS Statistics Version 19.0），數(shù)據(jù)處理和作圖采用Excel 2010。

2　結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯苗期抗寒性直接評價體系的建立

以‘ACL-27’、‘10908-06’及‘PUR206-1’為試驗材料，分別在-1，-2，-3，-3.5和-4℃5個溫度下進行24 h黑暗處理后于20℃放置1 d（16 h光照/8 h黑暗），統(tǒng)計植株整體損傷程度。試驗結(jié)果（表2）表明，-1和-2℃處理后，3個材料均沒有凍傷癥狀；-3℃處理后，低溫敏感材料‘10908-06’出現(xiàn)一定程度凍傷，‘ACL-27’和‘PUR206-1’則沒有明顯的凍傷癥狀；-3.5℃處理后，‘ACL-27’輕微凍傷，表現(xiàn)為抗寒，而‘PUR206-1’的傷害指數(shù)為3.32，表現(xiàn)出明顯傷害，‘10908-06’則全株均死；-4℃處理后，‘10908-06’和‘PUR206-1’全株死亡，‘ACL-27’也表現(xiàn)一定程度的傷害，冷凍損傷評級為2.17。本試驗中冷凍損傷評級結(jié)果小于2.00的材料常溫恢復(fù)后能正常生長，損傷評級結(jié)果在4.00以上的材料恢復(fù)常溫后枯死或不能正常生長。故在高于-3℃處理時，選擇壓較小，無法區(qū)分出材料間的抗寒能力，而低于-4℃則選擇壓過大，也達不到篩選抗寒材料的效果（圖1）?；谇叭藞蟮礼R鈴薯栽培種抗寒性整體較差的原因，建議在野生種抗寒資源篩選時選擇了-3.5℃處理，而栽培種及其雜交后代的抗性鑒定時采用-3℃處理較為合適。

表2　不同抗性材料的霜凍損傷評級Table 2 Freezing scores of different materials

圖1　3個材料不同溫度處理后20℃恢復(fù)24 h的表型Figure 1 Different phenotypes of three lines recovered for 24 h under 20℃after different temperature treatments

2.2馬鈴薯抗寒材料篩選

根據(jù)2.1建立的抗寒鑒定標(biāo)準(zhǔn)，分別以‘ACL-27’和‘10908-06’為抗、感對照，采用-3.5℃處理溫度，對40份試驗材料進行苗期抗寒能力的直接鑒定。結(jié)果表明，以冷凍損傷評級小于2.00為抗寒標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出21份抗寒材料，占本次試驗全部材料的52.5%，其中包括S. acaule等8個野生種的18份材料和雜交組合

S. piurana×S. chomatophilum 3份材料，低溫處理后這些抗寒材料的植株出現(xiàn)輕微凍傷或沒有凍傷，恢復(fù)常溫后仍可正常生長；冷凍損傷評級大于或等于2.00，且小于4.00的有來源于S. megistacrolobum ssp. toralapanum和S. piurana的3份中抗材料，占試驗材料的7.5%，低溫處理后的植株雖未完全死亡，但生長勢明顯減弱；而來源于S. tuberosum等7個種的16份低溫敏感材料霜凍損傷評級大于或等于4.00，占全部實驗材料的40.0%，低溫處理后，其植株表型為幾乎全部葉片及莖稈遭受重度凍傷甚至全株死亡，恢復(fù)常溫后，莖稈失水嚴(yán)重甚至干枯。

2.3不同基因型的非馴化LT50測定

以抗寒野生種‘ACL-27’與不抗寒栽培種‘10908-06’為對照，利用電解質(zhì)滲漏法測定了40份馬鈴薯材料的非馴化抗寒性，結(jié)果表明，LT50分布范圍為-1.74~ -5.60℃（表3）。同時對40份材料的LT50進行聚類分析，利用組間聯(lián)接的聚類方法，在歐氏距離平方為5.0時，可將40份馬鈴薯材料劃分為4類（圖2）。

第一類為7份高抗寒性材料，分別是‘ACL-27’、‘ACL513-5’、‘ALB464-3’、‘CHM559-1’、‘AEM669-4’、‘ACA1-3’和‘ALB462-2’7個材料，這7份材料未馴化的LT50值在-4.76~ -5.60℃之間。

第二類為5份抗寒性材料，分別是‘PUT14-1’、‘MLM266-2’、‘ACA1-2’、‘7782-24’和‘7782-17’5個材料。這5份材料未馴化的LT50范圍為-4.19~-4.53℃。

第三類為16份中間抗寒型材料，主要有‘鄭薯5號’、‘DMS364-6’、‘川芋早’、‘10908-06’、‘DMS264-1’、‘TOR705-2’、‘TOR704-5’和‘PUR206-1’等，這類材料的未馴化的LT50值在-2.82~-3.83℃之間。

第四類為12份敏感型材料，主要包括‘DMS-11’、‘DMS364-2’、‘南中552’、‘鄂薯5號’、‘冀張薯8號’、‘HJT349-3’、‘CHC9701’、‘RH89-039-16’、‘華恩1號’、‘IVP-196-2’、‘BUK512-3’和‘CW2-1’，這12份材料的未馴化的LT50值在-1.74~-2.51℃之間。

2.4苗期抗寒能力鑒定結(jié)果與非馴化LT50的相關(guān)性分析

對本研究中苗期抗寒能力體系取得的鑒定結(jié)果與40份材料的LT50值進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明這些材料的苗期抗寒鑒定結(jié)果與LT50呈極顯著直線相關(guān)（Y = 8.65 + 1.75X，r = 0.86，P < 0.01），表明馬鈴薯苗期抗寒能力直接鑒定體系是一種有效評價馬鈴薯抗寒能力的方法（圖3a）；但由于LT50小

于-4℃的材料，苗期抗寒鑒定結(jié)果大多數(shù)處于0～1之間，因此，利用LT50大于-4℃而小于-2℃的24份材料苗期抗寒鑒定結(jié)果與LT50測定結(jié)果進行相關(guān)性分析，得到的直線相關(guān)關(guān)系更為顯著（Y = 13.25 + 3.35X，r = 0.90，P < 0.01）（圖3b）。

表3　試驗材料的霜凍損傷評級及非馴化LT50測定Table 3 Freezing scores of materials and determination of non-acclimated freezing tolerance (NA)

圖2　40份試驗材料冷馴化前的LT50聚類分析Figure 2 Cluster analysis for forty experimental materials’LT50before cold acclimation

圖3　40份(3a)和24份(3b)材料非馴化LT50值與人工冷凍損傷結(jié)果相關(guān)性Figure 3 Correlation between freezing scores and non-acclimated freezing tolerance for forty experimental materials (3a) and twenty-four experimental materials (3b)

3　討論

目前，對馬鈴薯材料抗寒能力鑒定的常用方法主要有電解質(zhì)滲漏法[1,3]和田間自然霜凍鑒定法[4]，電解質(zhì)滲漏法能對馬鈴薯材料的抗寒性進行量化，可以有效的測定馬鈴薯材料馴化前后的抗寒能力及是否具有馴化能力，所測得的結(jié)果較為準(zhǔn)確，但對儀器設(shè)備及其精度都要求較高，且工作時間和周期較長，難以在短時間內(nèi)完成大量材料的抗寒能力鑒定。田間自然霜凍法雖然方便、簡單，且適合大量材料的抗寒性篩選，但具有嚴(yán)格的季節(jié)限制，且田間處理的溫度和時間均無法人為控制，溫度過高或過低對馬鈴薯材料的抗寒性評價都會造成較大出入，很難達到理想的效果。

本研究通過可控溫度和時間條件下，對馬鈴薯苗期植株進行低溫處理，建立了馬鈴薯苗期抗寒能力的直接評價體系，并將該方法與電解質(zhì)滲透法測定結(jié)果進行了比較，兩種方法的結(jié)果呈現(xiàn)極顯著相關(guān)，說明該方法具有較高可信度，能用于評價馬鈴薯材料在低溫霜凍環(huán)境下的存活情況。同時，由于該體系需要的植株數(shù)較少，且結(jié)果直觀，可用于大量材料的抗寒性篩選，是一種高通量的鑒定馬鈴薯抗寒能力的理想方法，但由于直接苗期鑒定法只在一個溫度點對植株進行處理，使得當(dāng)馬鈴薯材料的LT50值小于-4℃時，該方法的鑒定結(jié)果主要處于0~1之間，無法有效的反映這個區(qū)間段內(nèi)材料的實際抗寒能力。因此，當(dāng)需要對大量材料進行初步鑒定時，苗期抗寒性直接鑒定法較為合適，而對一些抗寒性較強的材料的具體抗寒程度評價時，LT50測定將是更好的選擇。此外，馬鈴薯的抗寒性分為馴化抗寒性和非馴化抗寒性[10]，本研究中抗寒能力的直接評價體系是在非馴化條件下探索出來的，沒有對試驗材料的馴化抗寒性與其馴化LT50進行相關(guān)分析，因此，該方法在馴化抗寒性鑒定方面還有待進一步完善。

馬鈴薯普通栽培種（S. tuberosum）幾乎不存在抗寒性，僅能忍受適當(dāng)?shù)睦鋬觯↙T50= -3℃），然而幾個野生種則表現(xiàn)出一系列不同的耐凍水平[11-13]。

本研究通過電解質(zhì)滲透法和直接評價體系對40份馬鈴薯材料進行了抗寒能力測定，結(jié)果顯示，S. acaule、S. albicans、S. commersonii ssp. malmeanum等5個種具有較強的抗寒性；S. piurana、S. demissum、S. megistacrolobum等8個種均表現(xiàn)為中等抗寒；S. tuberosum、S. phureja、S. hjertingii等7個種表現(xiàn)為幾乎不抗寒，這與前人的研究結(jié)果一致[4,11-13]，而且進一步LT50測定，獲得了這些材料的具體抗寒能力，從中篩選得到了一批具有較強抗寒能力的馬鈴薯材料，為后期的抗寒育種提供了材料基礎(chǔ)。

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Establishment and Application of Direct Cold-resistance Evaluation System for Potato Seedlings

TU Wei, ZHAO Xijuan, KOU Shuang, KANG Li, CHEN Lin, SONG Botao*

( College of Horticulture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (HAU), Ministry of Education/National Center for Vegetable Improvement (Central China), Huazhong Agricultural University，Wuhan, Hubei 430070, China )

Abstract:The potato cultivars acclimate to cool or temperate climates, normally without tolerance to frost. In this study, 16 068 hybrids derived from 137 cultivar crosses were screened for their tolerance to -3 ℃ at the seedling stage.Results showed thatmost hybrids died at -3 ℃, with an average survival rate of 2.81%. If the survival rate criterion was set at 5% or more, in total 26 crosses could be identified, which came from 13 freezing-tolerant female parents and seven freezing-tolerant male parents. Then, the semi-lethal temperature (LT50) of these parents was tested and correlation analysis of these data was made with the predicted survival rate of freezing-tolerant parents. Results showed that these freezing-tolerant male and female parents indeed had low LT50 and the correlation was highly significant. Thus, all the crosses were divided into three classes, of which the survival rate of hybrids from freezing-tolerant parents was considerably higher than the average. In contrast, the survival rate of hybrids from freezing-sensitive parents was considerably lower than the average. These results illustrated that it was better to use freezing-tolerant parents to breed potato against frost, which wasmore likely to harvest freezing-tolerant hybrids.

Key Words:potato; cold resistance; evaluation system

*通信作者（Corresponding author）：宋波濤，教授，博士，主要從事馬鈴薯遺傳育種與分子生物學(xué)研究，E-mail: songbotao@mail.hzau.edu.cn。

作者簡介：涂衛(wèi)（1988-），男，碩士研究生，從事馬鈴薯遺傳育種研究。

基金項目：國家馬鈴薯現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-10-P06）；公益性行業(yè)專項（201303007）；黔農(nóng)科院自主創(chuàng)新科研專項字（2014）015號。

收稿日期：2015-01-06

文章編號：1672－3635（2015）01-0001-07

文獻標(biāo)識碼：A

中圖分類號：S532