滌痰通瘀方干預(yù)急性腦出血大鼠肝組織IRAK-M表達變化的影響

王威1，許曉英1，馬迪1，趙海濱1*，唐杰2，張秀靜1，王帥1，翟瑤瑤1，張淑靜3

(1.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京房山區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，北京 102400；

3.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

摘要：目的研究急性腦出血大鼠肝組織中IRAK-M表達的變化,并探討滌痰通瘀方劑對急性腦出血大鼠肝損害的干預(yù)作用。方法通過建立SD大鼠急性腦出血模型，并隨機分為中藥組(酒大黃、膽南星、石菖蒲、蒲黃、三七、水蛭)、腦出血組、假手術(shù)組、正常組，每組分為24、48、72 h 3個時間亞組,檢測每組肝臟組織IRAK-M蛋白表達水平及肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,并觀察肝組織HE染色結(jié)果。結(jié)果腦出血模型組在造模后各個時間點IRAK-M蛋白表達水平較假手術(shù)組及正常組均明顯降低(P<0.05)；中藥治療組的IRAK-M蛋白表達水平較腦出血模型組明顯升高(P<0.05)，與假手術(shù)組、正常組相比略有降低；中藥治療組及腦出血模型組肝臟IRAK-M蛋白表達水平與組織TNF-α水平呈負相關(guān)。結(jié)論IRAK-M蛋白表達水平升高可能是抑制腦出血后誘發(fā)的LPS胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)炎性級聯(lián)反應(yīng)的重要因素；滌痰通瘀方劑可加強IRAK-M激酶活性，從而抑制炎癥因子的釋放,減輕急性腦出血大鼠肝臟損傷的程度。

關(guān)鍵詞：白細胞介素-1受體相關(guān)激酶-M;急性腦出血;肝損害;滌痰通瘀法;腫瘤壞死因子-α

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.11.023

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

基金項目:國家自然科學基金(81373590)。

作者簡介:王威(1983-)，女，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治心腦血管疾病研究。

收稿日期:(責任編輯：張瑞彬2014-12-16)

*通信作者:趙海濱,電話-(010)52075211,電子信箱-haibin999@126.com

IRAK-M in liver during acute cerebral hemorrhage and effects of Ditantongyu measure

WANG Wei1,XU Xiaoying1,MA Di1,ZHAO Haibin1*,TANG Jie2,ZHANG Xiujing1,

WANG Shuai1,ZHAI Yaoyao1,ZHANG Shujing3

(1.The 3rd Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;

2.Fangshan District Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102400,China;

3.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the change of expression of IRAK-M in liver during Acute Cerebral Hemorrhage,and discuss the protection mechanism of Ditantongyu Measure.MethodsThe model of acute cerebral hemorrhage was established.The animals were randomly divided into three groups: TCM treatment group (the rhubarb,bravery south star,stone calamus,cattail pollen,notoginseng,leech),cerebral hemorrhage group,sham surgery group,blank control group.And each group was further divided into 3 time-point sub-groups of 24,48 and 72 h.The expression level of hepatic IRAK-M protein was measured,the hepatic content of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were detected,and HE staining results of liver tissue are observed.ResultsCompared with Group S and Group B,the expression levels of IRAK-M protein at each time-point post-modeling in both Groups T had markedly reduced (P<0.05).Groups T elevated markedly compared with Group C (P<0.05),but it decreased in Group S and Group B.The expression level of hepatic IRAK-M protein in Group T and Group C was negatively correlated with the changes of hepatic content of TNF-α.ConclusionIncrease of IRAK-M protein expression may be an important factor in the inhibition of after cerebral hemorrhage induced intracellular signal transduction of the inflammatory cascade reaction;Ditantongyu Measure can enhance the activity of IRAK-M,and it can restrain release of inflammatory factor,thus alleviating liver injury of rats with acute cerebral hemorrhage.

Keywords:Inter-leukin-1 Receptor Associated Kinase-M (IRAK-M);acute cerebral hemorrhage;liver injury;Ditantongyu measure;tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)

急性腦出血是一種常見的腦血管疾病，極易致殘，甚至導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，或多器官功能障礙綜合征(MODS)，更嚴重者可出現(xiàn)死亡。急性腦出血后，下丘腦功能紊亂，使內(nèi)毒素生成增加，同時腸黏膜屏障受損，繼而發(fā)生細菌易位，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，最終導(dǎo)致肝損害[1]。內(nèi)毒素又名脂多糖(LPS),可激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)(MPS)，引起肝組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥介質(zhì)大量釋放，從而導(dǎo)致肝損傷[2]。近年來一些研究表明,白介素-1受體相關(guān)激酶-M(IRAK-M)可以通過阻止特定的免疫復(fù)合物的形成或分離而中斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而對由脂多糖誘導(dǎo)的一系列炎性級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)作用。但其在腦出血肝損害中的變化及影響尚缺乏相關(guān)實驗研究。本研究在既往急性腦出血肝損害模型研究的基礎(chǔ)上,研究急性腦出血大鼠肝組織中IRAK-M表達的變化，并探討滌痰通瘀方對其干預(yù)的影響。

1材料與方法

1.1動物與試劑選取健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(250±50)g，由北京維通利華實驗動物公司提供；滌痰通瘀方劑(酒大黃6 g，膽南星10 g，石菖蒲10 g，蒲黃15 g，三七10 g，水蛭10 g)由北京康仁堂中藥有限公司提供。兔抗大鼠IRAK-M多克隆抗體(abcam公司，美國，貨號ab8116)，二抗山羊抗兔IgG(H+L)，HRP(天德悅，貨號S004)；Rat TNF-α ELISA kit(欣博盛公司，貨號：ERC102a.96)。

1.2分組及模型制備將SD大鼠隨機分為中藥治療組、腦出血模型組、假手術(shù)組、正常組4組，按照動物觀察時間點平均分為造模后24、48、72 h各3個亞組,每組5只。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，實驗造模前12 h禁食，自由飲水。參照相關(guān)文獻[3]采用膠原酶注射法復(fù)制腦出血模型，并根據(jù)實驗需要做一定改進。該法通過立體定向手術(shù)可造成各種部位的腦出血，且可通過控制Ⅶ型膠原酶量做分級實驗性腦出血研究。鑒于臨床腦出血以基底節(jié)多發(fā)，且肝損害多繼發(fā)于嚴重腦出血。經(jīng)過預(yù)實驗分析和前期國家自然基金研究證實[4],本研究采用Ⅶ型膠原酶0.6 U注入大鼠基底節(jié)尾狀核復(fù)制模型：10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，俯臥固定于動物頭顱立體定位儀上。根據(jù)大鼠大腦立體定位圖譜，調(diào)整立體定向儀使門齒溝平面比耳間線平面低2.4 mm，此時前囟和后囟基本上在同一平面上；將頭部背側(cè)的鼠毛剪去，皮膚消毒后頭皮十字切開，暴露顱骨，取前囟為原點，向右3 mm，向后0.1 mm處用牙科鉆鉆一個直徑約1 mm的圓孔，采用微量注射器沿鉆孔方向垂直進針，深約5 mm(為尾狀核位置)，進針后緩慢注射Ⅶ型膠原酶0.6 U，留針5 min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，消毒，縫合皮膚。假手術(shù)組于大鼠基底節(jié)尾狀核處注入等量的生理鹽水。中藥治療組和西藥治療組于腦出血造模手術(shù)前2 d開始灌胃給藥，1次/d，手術(shù)前2 h加灌1次，手術(shù)后每天灌胃1次，各時相點處死前2 h加灌1次；腦出血模型組和假手術(shù)組給予相同劑量蒸餾水，大鼠給藥量按《藥理實驗方法學》[5]所示劑量換算法計算：大鼠用藥劑量(g/kg)=6.25×成人用藥劑量(g/kg)。

1.3檢測指標1)各組肝臟組織IRAK-M蛋白表達水平：采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測，提取肝組織總蛋白，并進行定量檢測后，經(jīng)過制膠、上樣及電泳，選用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在100 V電壓下轉(zhuǎn)膜，并用脫脂奶粉封閉后，分別加入兔抗大鼠IRAK-M多克隆抗體及HRP標記的羊抗兔IgG孵育，最后加入ECL發(fā)光夜在暗室中室溫下曝光顯色，用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)對目的條帶進行密度分析。2)各組肝臟組織TNF-α含量：提取肝組織總蛋白，并進行定量檢測后，按照ELISA試劑盒說明方法檢測TNF-α含量。3)各組肝組織病理檢測：冰上打開腹腔，分別進行腹主動脈取血處死，分離取材肝右后葉組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚6 μm，58 ℃烘烤48 h，HE染色，在光鏡下進行病理觀察。

2結(jié)果

2.1各組肝臟IRAK-M蛋白表達水平的變化比較假手術(shù)組在肝臟中IRAK-M的表達處于較高水平，并且不隨時間變化，與正常組比較各時間點均無顯著差異；腦出血模型組與正常組比較IRAK-M表達明顯降低，但在72 h時間點差異無統(tǒng)計學意義;中藥治療組中IRAK-M的表達較腦出血模型組升高，24 h時開始升高(P<0.05)，48 h時顯著升高(P<0.01)，72 h時略有降低(見表1)。

組 別24h48h72h中藥組 0.85750±0.05123△ 0.74500±0.04435△△0.85760±0.05916△模型組 0.73500±0.04203##0.59000±0.03651##0.75500±0.06758 假手術(shù)組1.05250±0.07136△△0.99000±0.08832△△0.92250±0.04031 正常組 1.10250±0.09979 0.88750±0.03500 0.71470±0.08616

注：與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.2各組肝臟TNF-α含量的變化比較與正常組相比，腦出血模型組各時間點TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)。中藥治療組各時間點TNF-α水平均較正常組略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義，假手術(shù)組在72 h顯著升高(P<0.01),其余時間點差異無統(tǒng)計學意義；中藥組與腦出血模型組比較在24 h時TNF-α水平有所降低(P<0.05)，48 h，72 h時均顯著降低(P<0.01)，假手術(shù)組各時間點TNF-α水平較模型組比較均降低，但24 h時差異無統(tǒng)計學意義，48 h及72 h組均顯著降低(見表2)。

表2　各組肝臟TNF-α含量的變化

注：與腦出血組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.3肝組織病理學觀察HE染色顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可辨，組織結(jié)構(gòu)完整正常，無肝細胞變性壞死，肝細胞索排列整齊，肝竇及中央靜脈無異常，中央靜脈管壁由一層內(nèi)皮細胞圍成，向四周呈放射狀排列成肝板。肝細胞多邊形，橢圓球形，位于細胞中央，被染成藍色，胞質(zhì)被染成紫紅色，細胞界限清晰。肝血竇位于肝板之間，結(jié)構(gòu)清晰完整。

腦出血模型組肝臟組織切片，肝小葉結(jié)構(gòu)大部分清晰可辨，大部分肝細胞索排列整齊，肝竇及中央靜脈無異常，中央靜脈管壁由一層內(nèi)皮細胞圍成，管壁上有一些肝血竇開口，肝細胞以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列成肝板，有炎癥細胞浸潤現(xiàn)象及出血現(xiàn)象。

假手術(shù)組肝臟組織切片可見，肝組織結(jié)構(gòu)完整正常，肝細胞索排列整齊，肝竇及中央靜脈無異常，中央靜脈管壁由一層內(nèi)皮細胞圍成，向四周呈放射狀排列成肝板。肝細胞多邊形，橢圓球形，位于細胞中央，細胞界限清晰。肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，偶有炎細胞浸潤。

中藥組肝臟組織切片，肝組織出現(xiàn)少量肝細胞腫大現(xiàn)象，細胞形態(tài)不清晰，有少量炎癥細胞浸潤，且伴有少量出血現(xiàn)象。肝小葉結(jié)構(gòu)仍清晰可辨，大部分肝細胞索排列整齊，肝竇及中央靜脈無異常，中央靜脈管壁由一層內(nèi)皮細胞圍成，管壁上有一些肝血竇開口，肝細胞以中央靜脈為中心，向四周呈放射狀排列成肝板。

3討論

近年來，研究認為肝損傷與MODS同源，是由內(nèi)毒素、炎癥性因子、氧自由基、細胞凋亡等多因素參與、多種炎癥介質(zhì)共同作用的復(fù)雜的病理生理過程。對于急性腦出血后，下丘腦功能紊亂，使內(nèi)毒素生成增加，進而發(fā)生內(nèi)毒素易位誘發(fā)LPS胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)炎性級聯(lián)反應(yīng),釋放大量炎性因子導(dǎo)致肝損傷。因此了解復(fù)雜的炎癥反應(yīng)調(diào)控機制對研究出新的治療方法具有重要作用。

迄今為止，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)IRAK家族成員主要包括：IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M和IRAK-4，其中IRAK-1和IRAK-4有激酶活性，可激活信號通路；IRAK-2與IRAK-M無激酶活性，起負性調(diào)節(jié)作用[6]。而目前發(fā)現(xiàn) IRAK-M 在肝內(nèi)膽管上皮細胞胞質(zhì)和肝實質(zhì)細胞胞核、肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞、血液中單核/巨噬細胞、破骨細胞等均可表達[7-9]。肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)、CpG-DNA及NO供體GSNO等刺激可使IRAK-M的表達上調(diào)[10]。

急性腦出血后下丘腦功能紊亂，使LPS的生成增加，內(nèi)毒素過量易位，LPS信號首先經(jīng)肝KC的Toll樣受體4(TLR4)胞內(nèi)段與髓性分化蛋白88(MyD88)C末端的TLR結(jié)構(gòu)域相作用，進而IRAK-1、IRAK-4均結(jié)合到受體復(fù)合物，并導(dǎo)致IRAK-1磷酸化(活化)?；罨蟮腎RAK-1與受體復(fù)合物的親和力下降而分離，并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF6)形成復(fù)合物,引起TRAF6發(fā)生低聚作用，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致TNF-α等一系列炎癥細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達。而IRAK-M作為負性調(diào)節(jié)因子，通過抑制IRAK-4誘發(fā)的IRAK-1的磷酸化，穩(wěn)定TLR/My88/IRAK-4/IRAK-1復(fù)合物，阻止下游IRAK-TRAF6復(fù)合體形成，導(dǎo)致TLRs信號中斷[6]。

本研究通過建立大鼠腦出血模型表明，腦出血模型組的IRAK-M蛋白表達較中藥治療組明顯降低，并較假手術(shù)組及正常組顯著降低;而腦出血組肝臟中TNF-α水平較中藥組和正常組均顯著升高,與IRAK-M蛋白表達水平變化相反。而且病理觀察結(jié)果顯示，中藥組病變要較腦出血組輕,假手術(shù)組次之。該結(jié)果說明，在腦出血大鼠中由于內(nèi)毒素生成過量易位使IRAK-M的表達下調(diào)，從而使LPS通過TLR/IL-1R介導(dǎo)的炎癥信號通路開放，促使TNF-α等炎癥因子釋放，導(dǎo)致肝臟損害。

在肝臟中,TNF-α主要由肝枯否細胞產(chǎn)生，是肝發(fā)生炎性反應(yīng)時主要的致病因子。且已有研究表明，TNF-α能直接損害肝細胞，進而引起肝損傷[11]。DENG J C等[12]發(fā)現(xiàn)，在IRAK-M基因缺乏小鼠中組織炎癥反應(yīng)較正常小鼠顯著增強，同時檢測到TNF-α等炎癥因子的表達也明顯增強。本研究結(jié)果也提示了機體IRAK-M表達的缺乏可導(dǎo)致TNF-α表達的增強，從而增強相應(yīng)組織的炎癥發(fā)應(yīng),由此更進一步說明了IRAK-M的負性調(diào)節(jié)作用。

腦出血屬于中醫(yī)“出血性中風”范疇，其急性期以痰瘀腑實證候較為多見。中風的發(fā)生主要基于氣血虧虛，在各種誘因的刺激下出現(xiàn)心、肝、腎三臟陰陽失調(diào)，氣血逆亂，挾痰挾瘀，橫竄經(jīng)髓，而形成上實下虛，陰陽互不維系的危機證候。其病因主要包括風、火、痰、氣、血等，由于機體氣血陰陽失調(diào)，致津液不化，痰邪迅速滋生，兼之瘀血內(nèi)阻，血瘀則痰滯，痰瘀相兼為患[13]。故而本研究以滌痰通瘀方立法，選用由酒大黃、膽南星、石菖蒲、蒲黃、三七、水蛭組成的滌痰通瘀方劑進行干預(yù)治療。實驗結(jié)果顯示中藥治療組IRAK-M的表達較腦出血模型組明顯升高，而TNF-α水平較腦出血模型組卻顯著降低，說明滌痰通瘀方劑可以通過增強IRAK-M的表達,從而抑制肝組織內(nèi)部分炎癥因子的釋放而發(fā)揮保護肝臟的作用。而對于滌痰通瘀方劑對其的具體作用靶點仍有待進一步研究。

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