新疆地區(qū)維吾爾族、漢族健康人群Tbx20基因多態(tài)性研究

馬玉龍1， 趙龍2， 李曉梅2， 楊毅寧2， 馬依彤2， 謝翔2， 向陽(yáng)2

(1新疆阿克蘇地區(qū)第一人民醫(yī)院心內(nèi)科， 新疆阿克蘇843000;2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院冠心病一科, 烏魯木齊830054)

摘要：目的研究Tbx20基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(tagSNP)在新疆地區(qū)維吾爾族及漢族健康人群中的分布特征及其分布差異。方法收集1 000例維吾爾族和1 200例漢族健康人群的血液，選擇Tbx20基因的標(biāo)簽SNP：rs17675131、rs4720169、rs2532170,應(yīng)用TaqMan SNP基因分型的方法進(jìn)行基因型分析。結(jié)果維吾爾族人群rs17675131 3種基因型的分布頻率為:AA型11.5%，AG型48.5%，GG型40.0%；漢族人群的分布頻率為AA型4.5%，AG型34.0%，GG型61.5%，維、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。維吾爾族人群rs4720169 3種基因型的分布頻率為：AA型15.0%，AG型51.0%，GG型34.0%；漢族人群的分布頻率為AA型10.2%，AG型42.0%，GG型47.8%，維、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。維吾爾族人群rs2532170 3種基因型的分布頻率為：AA型16.0%，AC型51.0%，CC型33.0%；漢族人群的分布頻率為AA型11.0%，AC型44.0%，CC型45.0%，維、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維吾爾族A-A-A、G-A-A、G-G-C單體型分布頻率均高于漢族。結(jié)論Tbx20基因標(biāo)簽位點(diǎn)在新疆維吾爾族和漢族健康人群中的分布具有明顯的差異。維吾爾族人群突變頻率可能高于漢族人群。

關(guān)鍵詞：Tbx20基因； 標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性； 維吾爾族； 漢族

中圖分類號(hào)：R541.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.008

[收稿日期：2015-02-20]

Distribution of genetic polymorphisms of Tbx20 in healthy Chinese

Uygur and Han populations in Xinjiang

MA Yulong1, ZHAO Long2, LI Xiaomei2, YANG Yining2, MA Yitong2, XIE Xiang2， XIANG Yang2

(1DepartmentofCardiology,TheFirstPeople′sHospitalofXinjiangAksuRegion,

Aksu843000,China;2DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalof

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the single nucleotide polymorphism of Tbx20 gene in healthy Chinese Uygur and Han populations of Xinjiang． MethodsThe genotypes of the Tbx20 tag SNP rs17675131, rs4720169, rs2532170 were detected with the technique of Real-time fluorescent quantitative PCR in 1 000 healthy Chinese Uygur and 1200 healthy Chinese Han populations of Xinjiang. ResultsThe frequencies of AA，AG and GG genotypes of the rs17675131 were 11.5%，48.5%，and 40.0% in Uygurs，and 4.5%，34.0%and 61.5% in Hans, with a significant difference in the distribution of genotypes between the two populations (P<0.05)； The frequencies of AA， AG and GG genotypes of the rs4720169 were 15.0%， 51.0%， and 34.0% in Uygurs， and 10.2%， 42.0%and 47.8% in Hans, with a significant difference in the distribution of genotypes between the two populations (P<0.05)； The frequencies of AA， AG and GG genotypes of the rs2532170 were 16.0%， 51.0%， and 33.0 in Uygurs， and 11.0%， 44.0% and 45.0% in the Hans， with a significant difference in the distribution of genotypes between the two populations (P<0.05). The frequencies of haplotype A-A-A, G-A-A, G-G-C in Uygurs were proved higher than those in Hans. ConclusionThe mutational frequencies of the taggingSNPs of the Tbx20 gene in the Uygurs were likely to be higher than those in Hans．

Key words: Tbx20; single nucleotide polymorphism; Uygur population; Han population

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是常見(jiàn)的人類出生缺陷，是導(dǎo)致1歲以下嬰兒死亡的主要原因[1]，CHD是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用引起的復(fù)雜疾病，其中遺傳因素在其發(fā)病中起重要作用。近幾年來(lái)大量的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)Tbx20基因在心臟發(fā)育過(guò)程中起重要的作用，對(duì)心臟發(fā)育來(lái)說(shuō)，Tbx20基因相當(dāng)于調(diào)節(jié)中樞[2]，其可通過(guò)抑制或激活下游基因的表達(dá)來(lái)影響心臟的結(jié)構(gòu)及功能[3-5]。對(duì)鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，Tbx20在心臟祖細(xì)胞、發(fā)育心肌以及與心內(nèi)膜墊相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，缺失Tbx20基因的調(diào)控，小鼠的心臟幾乎不能發(fā)育[3]。Kirk等[6]首次在一房間隔缺損家系中發(fā)現(xiàn)人類Tbx20基因的2個(gè)突變； Max等[7]發(fā)現(xiàn)Tbx20突變同房間隔缺損、擴(kuò)張性心臟病及瓣膜病有關(guān)；喬艷等[8]發(fā)現(xiàn)Tbx20突變同室間隔缺損有關(guān)，這些研究結(jié)果都提示人類Tbx20基因突變同先天性心臟病可能存在關(guān)聯(lián)性。

然而，目前對(duì)Tbx20基因多態(tài)性的分型數(shù)據(jù)較少，且主要為歐洲白人、非洲人、日本人和中國(guó)漢族人群，對(duì)于新疆維吾爾族人群尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)新疆維吾爾族及漢族健康人群Tbx20基因標(biāo)簽位點(diǎn)進(jìn)行分型，探討其TagSNP在不同種族人群中的分布特征及其差異。

1對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象2006-2009年參與新疆不同民族心血管危險(xiǎn)因素調(diào)查人員2 200人，其中維吾爾族1 000人，漢族1 200人，身高、體質(zhì)量、血壓等由專人測(cè)量；血總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖等生化指標(biāo)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)中心統(tǒng)一測(cè)定，剔除檢驗(yàn)不合格及資料不全者。經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。

1.2儀器及試劑ABl7900型實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(ABI公司)，NANOdrop2000分光光度計(jì)(Thermo公司)，TaqMan Universal PCR master Mix試劑盒(含dNTP、PCR緩沖液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶)及SNP Genotyping Product試劑盒(含引物和探針)均購(gòu)自ABI公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取采用全血基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取外周血白細(xì)胞DNA，并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，保證各DNA樣本濃度基本一致。

1.3.2SNP位點(diǎn)選擇登陸人類HapMap計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)查找標(biāo)簽SNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，設(shè)置條件為r2≥0.5，最小基因頻率≥0.1，獲得了Tbx20基因的3個(gè)標(biāo)簽SNP(Tag SNPs),分別為 rs17675131、rs4720169、rs2532170。

1.3.3TaqMan法檢測(cè)SNP采用TaqMan法檢測(cè)SNP，在ABI7900型實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀上先進(jìn)行96孔板的絕對(duì)定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液為：引物/探針混合液0.12 μL、PCR反應(yīng)混合液3 μL、ddH2O 1.88 μL；基因組DNA：1 ng。反應(yīng)條件為：95℃10 min預(yù)變性，95℃15 s，60℃1 min(40個(gè)循環(huán))，PCR反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)在同一孔板上應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀Data Analysis軟件(美國(guó)應(yīng)用生物公司)，讀取熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)變化進(jìn)行等位基因分布檢測(cè)，保存記錄。

1.3.4DNA測(cè)序分析為驗(yàn)證TaqMan@SNP基因分型方法的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑取不同基因型的16個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序。

2結(jié)果

2.1維吾爾族和漢族人群一般資料的比較維吾爾族和漢族人群年齡和性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。維吾爾族人群體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、腰圍、總膽固醇均低于漢族人群(P<0.01)，維吾爾族、漢族人群身高、尿素氮、血糖、肌酐、甘油三酯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　維吾爾族、漢族人群一般資料比較

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)維吾爾族人群和漢族人群基因型分布均符Hardy-Weinberg平衡(P>0.05), 有群體代表性，見(jiàn)表2。

2.3測(cè)序結(jié)果16份樣本PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果與TaqMan@SNP基因分型結(jié)果完全一致。

表2　維吾爾族、漢族人群基因型分布Hardy-Weinberg檢測(cè)

2.4基因型和等位基因分布頻率比較(1)維吾爾族人群rs17675131 3種基因型的分布頻率為：AA型11.5%，AG型48.5%，GG型40.0%；漢族人群的分布頻率為AA型4.5%，AG型34.0%，GG型61.5%，維吾爾族、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維吾爾族人群等位基因A、G的分布頻率為34.7%、65.3%，漢族人群的分布頻率為21.5%、78.5%，維、漢族人群分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)維吾爾族人群rs4720169 3種基因型的分布頻率為：AA型15.0%，AG型51.0%，GG型34.0%；漢族人群的分布頻率為：AA型10.2%，AG型42.0%，GG型47.8%，維、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維吾爾族人群等位基因A、G的分布頻率為40.2%、59.8%，漢族人群的分布頻率為31.2%、68.8%，維、漢族人群分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)維吾爾族人群rs2532170 3種基因型的分布頻率為：AA型16.0%，AC型51.0%，CC型33.0%；漢族人群的分布頻率為AA型11.0%，AC型44.0%，CC型45.0%，維、漢族人群基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；維吾爾族人群等位基因A、C的分布頻率為41.5%、58.5%，漢族人群的分布頻率為33.0%、67.0%，維、漢族人群分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5單體型分析3個(gè)位點(diǎn)通過(guò)SHEsis在線軟件構(gòu)件單體型，維吾爾族人群A-A-A、G-A-A、G-G-C單體型分布頻率均高于漢族，結(jié)果見(jiàn)表4。

3討論

Tbx20基因定位于7號(hào)染色體，有8個(gè)外顯子，其289～888核苷酸及相應(yīng)氨基酸編碼T-boxDNA結(jié)合域，通過(guò)此功能結(jié)構(gòu)域與特異DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在心臟發(fā)育中突變的Tbx20與Tbx5、Gata4、Gata5、Isll和Nkx2．5等其他心臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而調(diào)節(jié)上游或下游轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致心臟發(fā)育缺陷[10]。

表3維吾爾、漢族人群Tbx20基因型及等位基因分布頻率比較/例(%)

維吾爾族漢族P值rs17675131基因型A/A115(11.5)54(4.5)A/G485(48.5)408(34.0)0.000G/G400(40.0)738(61.5)等位基因A347(34.7)258(21.5)0.001G653(65.3)942(78.5)rs4720169基因型A/A150(15.0)122(10.2)A/G510(51.0)504(42.0)0.000G/G340(34.0)574(47.8)等位基因A402(40.2)374(31.2)0.001G598(59.8)827(68.8)rs2532170基因型A/A160(16.0)132(11.0)A/C510(51.0)528(44.0)0.000C/C330(33.0)540(45.0)等位基因A415(41.5)396(33.0)0.001C585(58.5)804(67.0)

表4　維吾爾、漢族人群?jiǎn)误w型分析

新疆是一個(gè)多民族地區(qū)，各個(gè)民族生活習(xí)慣差異很大，不同民族的遺傳背景差異可能造成他們對(duì)某些疾病的易感性差異。對(duì)不同民族基因多態(tài)性的研究有助于了解各種基因在不同人群中的分布及其與疾病的關(guān)系?；谝陨显?，本研究選擇了Tbx20標(biāo)簽SNP：rs17675131、rs4720169、rs2532170。在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，該3個(gè)位點(diǎn)在歐洲猶他州人中的突變頻率分別為0.117、0.15、0.175；在非洲尼日利亞人中的突變頻率分別為0.068、0.283、0.275；在東京人中的突變頻率分別為0.111、0.222、0.31；在我國(guó)北京漢族人中的突變頻率分別為0.044、0.089、0.114。本研究結(jié)果提示，該3個(gè)位點(diǎn)在新疆漢族人群的突變與北京漢族人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在新疆維吾爾族人群中的突變頻率明顯高于漢族人群(0.115、0.15、0.16)，與歐洲人該3個(gè)位點(diǎn)的突變頻率(0.117、0.15、0.175)接近，且單體型分析示，維吾爾族A-A-A、G-A-A、G-G-C單體型分布頻率均高于漢族。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為同義突變未導(dǎo)致氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，不會(huì)引起蛋白功能變化。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，位于內(nèi)含子上的單核苷酸多態(tài)性可能直接影響mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生微小變化而影響其功能[11]。另有研究證實(shí)，位于內(nèi)含子的基因多態(tài)性即使不引起氨基酸替換，也可能通過(guò)影響mRNA的結(jié)構(gòu)折疊或蛋白翻譯的速率(因稀有密碼子的使用)而引起表型改變[12-13]。Evans等[14]發(fā)現(xiàn)編碼P-糖蛋白的ABCB1基因上的同義突變C3435T可以使地高辛生物利用率明顯升高。本研究顯示3個(gè)位點(diǎn)雖位于內(nèi)含子，均為同義突變，但也可能通過(guò)上述原因最終影響轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因表達(dá)，導(dǎo)致先天性心臟病的發(fā)生。

綜上所述，Tbx20基因多態(tài)性在新疆維、漢族人群間的分布頻率存在明顯的差異，維吾爾族人群突變頻率高于漢族，此結(jié)果為后期研究Tbx20基因突變與新疆維、漢族先天性心臟病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯楊晨晨)