王曉玲，李亞妮，江 梅，李信民

1.西安市第四醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安710004;2.延安婦幼保健院內(nèi)科;3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室

便秘是由不同病理過程引起的一種復(fù)雜臨床癥狀，主要是指排便次數(shù)減少、糞便干結(jié)、排便費力等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量;腸道水代謝紊亂是便秘的主要發(fā)病機制，特別是結(jié)腸內(nèi)水轉(zhuǎn)運異常與其有直接關(guān)系。水通道蛋白(AQPs)是一個具有跨膜運輸水分子功能的蛋白家族，目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物消化道有9 種AQPs亞型表達(dá)，其中AQP1、3、4、8、9 在結(jié)腸有表達(dá)，與結(jié)腸內(nèi)水分的吸收和分泌關(guān)系密切，已有研究表明AQP4與水分吸收密切相關(guān)，而AQP9 則主要參與水分分泌［1-3］。本實驗通過構(gòu)建小鼠便秘模型，利用RT-PCR技術(shù)對便秘小鼠結(jié)腸黏膜AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行研究，探討其與便秘的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 體質(zhì)量(20 ±2.0)g 的雄性昆明小鼠20 只，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。小鼠隨機分為對照組和便秘組，每組10 只。

1.2 實驗藥品及試劑 復(fù)方地芬諾酯片(常州康普藥業(yè)有限公司);阿拉伯樹膠(滄州市康鑫蜂蠟?zāi)z業(yè)有限公司);活性炭(西安鑫寶佳業(yè)化工有限公司)。墨汁的配置［4］:稱取阿拉伯樹膠50 g，加水400 ml，煮沸至溶液透明，稱取活性炭25 g 加至上述溶液中煮沸3次，待溶液涼后加水定容至500 ml 備用。RT-PCR 試劑盒(MBI Fermentas 公司);RNA 提取液Trizol(美國Invitrogen 公司);瓊脂糖(北京奇松生物科技有限公司)DNA marker(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。1.3 方法

1.3.1 便秘模型構(gòu)建:參照文獻(xiàn)［5］，實驗小鼠均單只單籠飼養(yǎng)，實驗前12 h 禁食不禁水，便秘組給予50 mg/kg·BW 的復(fù)方地芬諾酯灌胃，陰性對照組給予等量的蒸餾水灌胃。灌胃后小鼠均正常飲食進(jìn)水，比較對照組與便秘組小鼠首粒排便時間、12 h 內(nèi)排便粒數(shù)和12 h 內(nèi)排便重量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，便秘模型制備成功。

1.3.2 取材:實驗小鼠以水合氯醛腹腔麻醉并處死，迅速取升、降結(jié)腸組織各1 塊放入EP 管中，置于-85℃冰箱，供反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)使用。

1.3.3 RT-PCR 測定結(jié)腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達(dá):首先按照Trizol 試劑盒說明書提取標(biāo)本中的總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在NCBI 基因庫中分別查出AQP4、AQP9 的基因序列，之后應(yīng)用Primer 軟件來設(shè)計各自的引物序列并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選用β-actin 基因為內(nèi)參照引物基因，反應(yīng)中所用的上游引物為:5＇-CTA CAA TGA GCT GCG＇TGT GCC-3＇，下游引物為5＇-CAG GTC CAG ACG ACG CAG GAT GGC-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為:270 bp;AQP4 上游引物為:5＇-GGG TTG GAC CAA TCA TAG GCG CT-3＇，下游引物為:5＇-GCA GGA AAT CTG AGG CCA GTT CTA GG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為:330 bp;AQP9 上 游 引 物 為:5＇-GATGCCTTCTGAGAAGGACA-3＇，下游引物為:5＇-CGATGCTCTTGGTATTGGCT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為:218 bp。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳及半定量分析:取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，置1%瓊脂糖凝膠中，TBE 電泳緩沖液中4 V/cm 電壓電泳60 min，用GDS7500 圖像分析系統(tǒng)(英國UVP 公司)進(jìn)行密度掃描定量，以AQP4、AQP9 基因與β-actin 比值表示AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以s 表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗呈正態(tài)分布，采用兩個獨立樣本t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

10 只便秘小鼠均造模成功，無小鼠死亡。對照組及便秘組小鼠升、降結(jié)腸均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表達(dá);便秘組升結(jié)腸中AQP4 mRNA 表達(dá)量高于對照組(P ＜0.05)，升結(jié)腸中AQP9 mRNA 兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);便秘組降結(jié)腸中AQP9 mRNA 低于對照組(P ＜0.05)，AQP4 mRNA 高于對照組(P ＜0.05，見表1)。

表1 便秘組和對照組升、降結(jié)腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 的表達(dá)量Tab 1 Expression of AQP4 mRNA and AQP9 mRNA in ascending and descending colon of constipation group and normal group

3 討論

便秘是臨床常見的復(fù)雜癥狀，按照病因可分為器質(zhì)性便秘和功能性便秘。器質(zhì)性便秘解除病因后便秘癥狀即可緩解;功能性便秘則根據(jù)病理生理學(xué)機制又可分為慢傳輸型便秘、出口梗阻型便秘和混合型便秘，其中慢傳輸型便秘在臨床上非常常見，主要指腸道動力降低、腸內(nèi)容物從近端結(jié)腸向遠(yuǎn)端結(jié)腸運動的速度低于正常人，引起腸道水代謝異常，糞便中水分的重吸收增加或分泌減少，導(dǎo)致大便含水量減少，大便干結(jié)，排便費力。

AQPs 是與水代謝密切相關(guān)的蛋白家族，主要分布在與體液吸收和分泌密切相關(guān)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，具有重要的病理生理意義［6-7］。AQP4、AQP9 在結(jié)腸均有表達(dá)，且其表達(dá)細(xì)胞有差異，AQP4 主要表達(dá)于吸收上皮細(xì)胞，而AQP9 主要表達(dá)于杯狀細(xì)胞，分別參與腸道的吸收和分泌功能［8-9］。

本實驗通過復(fù)方地芬諾酯灌胃構(gòu)建功能性便秘小鼠模型，研究其升、降結(jié)腸AQP4 mRNA、AQP9 mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組及便秘組小鼠升、降結(jié)腸均有AQP4 mRNA、AQP9 mRNA 表達(dá);兩組升結(jié)腸AQP4 mRNA 表達(dá)量均高于降結(jié)腸(P ＜0.01);便秘組升、降結(jié)腸AQP4 mRNA 表達(dá)量均較正常對照組升高(P ＜0.05)，提示便秘時AQP4 mRNA 表達(dá)增加，導(dǎo)致腸道糞便中的水分重吸收增加，糞便中含水量減少，大便干結(jié);便秘組升結(jié)腸AQP4 mRNA 升高更為顯著(P ＜0.01)，這與升結(jié)腸為結(jié)腸水分吸收的主要部位有關(guān)。同時我們研究發(fā)現(xiàn)便秘組升、降結(jié)腸AQP9 mRNA 表達(dá)均較對照組降低，提示便秘時AQP9 mRNA 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腸道液體分泌減少，大便干結(jié)，排便困難;便秘組與對照組比較，升結(jié)腸AQP9 mRNA 表達(dá)有所下調(diào)，但經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而降結(jié)腸比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明降結(jié)腸具有重要的分泌功能。

以上研究提示，AQP4、AQP9 在腸道水代謝中具有重要的病理生理意義，其表達(dá)異常與腸道水代謝紊亂性疾病密切相關(guān)，進(jìn)一步明確更多AQPs 與腸道水代謝異常疾病的關(guān)系，針對AQPs 的異常表達(dá)，研發(fā)相關(guān)的靶向藥物有望成為今后治療腸道水代謝紊亂性疾病的方向。

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