補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞反饋的炎癥應(yīng)答調(diào)控在過(guò)敏性紫癜中的作用

周貴濱1溫炬1李婷1秦思1

(南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510630)

摘要〔〕目的探討補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞反饋的炎癥應(yīng)答調(diào)控在過(guò)敏性紫癜(HSP)中的作用機(jī)制。方法選取24只清潔級(jí)日本大耳白兔為受試對(duì)象，分為正常組和模型組，每組12只。以干姜、蓽茇、胡椒水煎劑混合液的藥物灌胃，腹腔注射卵白蛋白-弗氏佐劑、耳緣靜脈和背部皮內(nèi)注射卵白蛋白生理鹽水的方式構(gòu)建過(guò)HSP模型。比較兩組兔的飲食、飲水量、體溫、血液常規(guī)和尿液常規(guī)變化及活性氧自由基(ROS)、炎性因子和補(bǔ)體成分的改變，同時(shí)以N-乙酰半胱氨酸(NAC)和過(guò)氧化氫(H2O2)干預(yù)ROS水平，并觀察上述指標(biāo)的變化。結(jié)果模型組兔在激發(fā)過(guò)敏后，體溫明顯升高,精神狀態(tài)萎靡、運(yùn)動(dòng)量減少，飲水量和飲食量均較致敏前顯著降低(P<0.05)；而且，血液常規(guī)指標(biāo)WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明顯升高，RBC、HGB、EOS和EOS%含量顯著降低(P<0.05)，而MCH和PLT則無(wú)明顯變化(P>0.05)；尿液出現(xiàn)拉絲、氣味大的情況，其中66.67%出現(xiàn)尿蛋白陽(yáng)性、58.33%出現(xiàn)尿紅細(xì)胞、25%尿白細(xì)胞陽(yáng)性；另外，模型組兔的ROS、炎性因子、TGF-β、補(bǔ)體水平也均明顯升高；在ROS抑制劑NAC處理之后，上述指標(biāo)水平明顯降低(P<0.05)，而在應(yīng)用ROS激動(dòng)劑H2O2處理之后，這些指標(biāo)卻明顯升高(P<0.05)。結(jié)論補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞反饋的炎癥應(yīng)答調(diào)控在HSP的形成中具有重要作用，抑制ROS水平能抑制HSP的發(fā)生和進(jìn)展。

關(guān)鍵詞〔〕過(guò)敏性紫癜；補(bǔ)體；中性粒細(xì)胞；炎癥應(yīng)答

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R55〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：溫炬(1966-)，男 ，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事皮膚性病方面的研究。

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南粵醫(yī)院廣東省第二人民醫(yī)院皮膚性病科

第一作者：周貴濱(1986-)，男，在讀碩士，主要從事皮膚性病方面的研究。

過(guò)敏性紫癜(HSP)又稱(chēng)許蘭-亨諾紫癜，是一種常見(jiàn)的異質(zhì)性、炎癥性和自身免疫性皮膚血管炎癥，其主要病理改變?yōu)檎嫫\層的白細(xì)胞破碎、血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等〔1〕。HSP多由外界變應(yīng)原如食物、藥物、細(xì)菌感染等多種致病因素的刺激引發(fā)〔2〕，但目前HSP的致病機(jī)制仍未闡明。免疫系統(tǒng)異常及免疫-炎癥反應(yīng)失調(diào)被認(rèn)為是誘發(fā)HSP的主要潛在致病機(jī)制〔3，4〕。補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原體入侵的主要效應(yīng)系統(tǒng)，并且補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞之間還存在一定的反饋炎癥應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，即補(bǔ)體活化激活中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)釋放的活性氧自由基能再次活化補(bǔ)體，在補(bǔ)體之間形成相互反饋活化、增強(qiáng)炎癥應(yīng)答的反應(yīng)〔5〕。當(dāng)前，該機(jī)制是否參與調(diào)控HSP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程尚不清楚。本研究擬探討補(bǔ)體活化和抑制情況下中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的應(yīng)答調(diào)控變化，以期為揭示HSP的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器卵白蛋白-弗氏佐劑(均可購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司，制作方法：將卵白蛋白溶于0.9%的生理鹽水，20 mg卵白蛋白/ml配制，并以1∶1的比例和弗氏佐劑混合)；白細(xì)胞介素(IL)-2，-4，-6，-8、活性氧自由基(ROS)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β和補(bǔ)體成分C3、C4、C5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；N-乙酰半胱氨酸(NAC)、過(guò)氧化氫(H2O2)，北京索萊寶生物科技有限公司；美國(guó)BIORAD酶標(biāo)儀，型號(hào)Model 680；恒溫水浴箱由河北黃驊儀器廠提供；721分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)16C14型；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇取24只健康清潔級(jí)日本大耳白兔〔購(gòu)自于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK(粵)2004.001〕，兔齡4月，雌雄各半，體重2.2～3.0 kg。將白兔按照體重隨機(jī)編號(hào)分為正常組和模型組各12只，雌雄各半。動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)動(dòng)物中心，溫度18℃～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，光暗照明時(shí)間各12 h，每籠1只，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作經(jīng)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3動(dòng)物模型構(gòu)建

1.3.1連續(xù)抗原刺激致敏將干姜、蓽茇、胡椒水煎劑(購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)用1∶1∶1的比例配置成終濃度為15 g/100 ml的液體溶液，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前2 w，正常組兔子每日給予200 g/只普通飼料；模型組兔子在比基礎(chǔ)之上灌胃1 ml上述藥液，每日1次，正常組用等量生理鹽水灌胃，其他條件盡可能保持一致。另外，模型組動(dòng)物還采取腹腔注射的方式加用卵白蛋白-弗氏佐劑每日1 ml/只，連續(xù)3 w，以達(dá)到連續(xù)抗原刺激致敏的目的，正常組動(dòng)物注射等量生理鹽水。

1.3.2抗原沖擊激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)腹腔注射3 w后，模型組動(dòng)物再通過(guò)耳緣靜脈注射0.5 ml濃度為10 mg/ml的卵白蛋白生理鹽水，背部皮膚剪毛，皮下分5個(gè)位置點(diǎn)注射0.3%卵白蛋白生理鹽水0.2 ml。在抗原沖擊激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)之后，觀察每點(diǎn)皮膚局部紅腫的情況以驗(yàn)證模型是否構(gòu)建成功。

1.4一般指標(biāo)觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別對(duì)兩組兔子進(jìn)行一般癥狀觀察：平均每天飲食、飲水量、體溫、血液常規(guī)和尿液常規(guī)；采取考馬斯亮藍(lán)法收集動(dòng)物24 h尿量，并測(cè)定24 h尿蛋白。

1.5ROS、炎性因子和補(bǔ)體水平檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)血清ROS、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β和補(bǔ)體C3、C4、C5水平；于96孔酶標(biāo)板每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取對(duì)照組和模型組兔各6只(雌雄各3只)，分別采取腹腔注射加用ROS拮抗劑NAC和促進(jìn)劑H2O2的方式，觀察對(duì)兩組兔子血清炎性因子及補(bǔ)體成分的影響。

2結(jié)果

2.1兔皮膚外部特征的變化皮下注射之后，兔皮膚注射位置均出現(xiàn)直徑1 cm左右的皮丘。持續(xù)觀察4～8 h之后，正常組兔背部的皮丘逐漸消失，而模型組兔背部的皮丘呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，且出現(xiàn)皮膚周?chē)M織水腫、皮下出血等癥狀。注射結(jié)束后24 h，模型組兔背部皮膚均呈現(xiàn)紫色斑塊，形狀不規(guī)則，大小不一，部分紫斑隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)結(jié)痂或壞死，而正常組兔的皮膚則無(wú)明顯改變。

2.2兔體溫、飲食、飲水量的變化正常組兔在致敏前、激發(fā)過(guò)敏后的體溫、飲食量和飲水量均無(wú)明顯改變(P>0.05)；而模型組兔在激發(fā)過(guò)敏后，精神狀態(tài)萎靡、運(yùn)動(dòng)量減少，飲水量和飲食量均較致敏前顯著降低(P<0.05)；與正常組相比，模型組兔在激發(fā)過(guò)敏后體溫明顯升高(P<0.05)，而進(jìn)食和飲水量則顯著減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別體溫(℃)致敏前激發(fā)過(guò)敏后P值飲食量(g)致敏前激發(fā)過(guò)敏后P值飲水量(ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后P值正常組38.41±0.1938.58±0.18>0.05200.45±10.63197.56±12.78>0.05308.25±22.93319.58±21.45>0.05模型組38.13±0.2239.05±0.24<0.05201.82±12.05163.92±9.84<0.05306.81±20.76286.52±14.93<0.05t/P值1.491/0.2934.591/0.0281.057/0.3145.190/0.0010.985/0.49612.582/<0.001

2.3兔血液、尿液常規(guī)的變化致敏前模型組和正常組血液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)比較均無(wú)明顯差異(P>0.05)，且激發(fā)過(guò)敏后正常組兔的血液常規(guī)指標(biāo)也無(wú)顯著改變(P>0.05)；但模型組兔激發(fā)過(guò)敏后，WBC、MCHC、NEU、NEU%水平明顯升高，RBC、HGB、EOS和EOS%含量顯著降低(P<0.05)，而MCH和PLT則無(wú)明顯變化(P>0.05)。另外，致敏前正常組和模型組兔的尿液常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)均基本正常，激發(fā)過(guò)敏后，正常組兔尿液無(wú)明顯變化，而模型組兔尿液出現(xiàn)拉絲、氣味大的情況，其中66.67%出現(xiàn)尿蛋白陽(yáng)性(8只)、58.33%出現(xiàn)尿紅細(xì)胞(7只)、25%尿白細(xì)胞陽(yáng)性(3只)，而24 h排尿量、尿糖、尿膽紅素、尿酮體、尿膽原、尿比重和酸堿度則均無(wú)明顯變化，24 h尿蛋白從103.25 mg/24 h升高至402.45 mg/24 h(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4兔ROS、炎性因子和補(bǔ)體水平變化致敏前正常組與模型組的ROS、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、TGF-β、補(bǔ)體C3、C4和C5的水平比較無(wú)明顯差別(P>0.05)；激發(fā)過(guò)敏后，正常組上述指標(biāo)未發(fā)生顯著改變，而模型組ROS、炎性因子、TGF-β、補(bǔ)體水平均明顯升高；而且，模型組兔的這些指標(biāo)水平也明顯高于正常組(P<0.05)。ROS抑制劑NAC處理之后，ROS、炎性因子、TGF-β和補(bǔ)體C3、C4和C5的水平明顯降低(P<0.05)，而應(yīng)用ROS激動(dòng)劑H2O2處理之后，上述指標(biāo)均明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別WBC(×1012/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后RBC(×1012/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后HGB(g/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后MCH(fl)致敏前激發(fā)過(guò)敏后MCHC(g/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后正常組6.81±1.237.20±1.855.55±0.685.93±0.89105.24±7.58104.29±7.0419.45±0.8420.45±0.92275.32±4.98278.49±4.09模型組6.90±1.1822.59±5.681)2)5.61±0.774.09±0.761)2)104.98±8.0492.58±6.451)2)19.08±0.9220.88±0.86274.76±5.32306.82±5.981)2)組別PLT(×109/L)致敏前 激發(fā)過(guò)敏后NEU(×109/L)致敏前 激發(fā)過(guò)敏后NEU(%)致敏前激發(fā)過(guò)敏后EOS(×109/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后EOS(%)致敏前激發(fā)過(guò)敏后正常組332.45±11.95334.46±10.850.18±0.040.20±0.082.45±0.922.52±0.891.88±0.791.86±0.7627.39±5.2326.93±4.94模型組330.83±12.34335.38±11.240.19±0.060.61±0.131)2)2.53±0.893.15±0.951)2)1.86±0.681.45±0.511)2)27.45±5.5720.48±5.291)2)

與致敏前比較:1)P<0.05；與正常組比較:2)P<0.05

組別ROS(IU/ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后IL-2(ng/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后IL-4(ng/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后IL-6(ng/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后IL-8(ng/L)致敏前激發(fā)過(guò)敏后正常組478.79±12.45480.22±13.536.28±0.896.50±1.1027.23±6.0328.11±4.877.02±1.357.15±1.2842.38±8.4243.11±7.28模型組482.28±11.29599.54±25.281)2)6.20±1.0215.32±2.351)2)26.96±5.2939.58±7.561)2)6.88±1.2019.55±3.591)2)41.97±7.9260.25±9.411)2)ROS抑制劑組-328.29±10.843)-10.85±2.103)-30.15±4.693)-10.36±2.42-49.27±8.023)ROS促進(jìn)劑組-682.13±28.493)-19.32±2.683)-46.92±6.023)-25.85±5.01-71.34±10.233)組別TGF-β(IU/ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后C3(μg/ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后C4(μg/ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后C5(μg/ml)致敏前激發(fā)過(guò)敏后正常組26.80±5.0827.98±4.8764.51±12.7465.56±10.322.54±0.682.67±0.7336.89±8.2338.32±9.43模型組27.04±4.9750.66±5.211)2)64.90±10.8875.75±14.651)2)2.78±0.767.98±1.031)2)37.03±7.1878.19±11.891)2)ROS抑制劑組-31.58±2.563)-67.59±11.303)-4.32±1.223)-48.30±10.393)ROS促進(jìn)劑組-60.23±6.293)-85.85±12.393)-10.56±2.483)-89.12±19.023)

與致敏前比較:1)P<0.05；與正常組比較:2)P<0.05；與模型組比較:3)P<0.05

3討論

本研究結(jié)果顯示，在HSP模型兔中，炎性因子水平明顯升高，而拮抗機(jī)體的ROS水平能夠減弱中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)應(yīng)答；并且，在炎癥反應(yīng)發(fā)生強(qiáng)度較大的情況下，模型兔的血液常規(guī)指標(biāo)，如WBC、MCHC、NEU、NEU%等水平也出現(xiàn)明顯異常改變以適應(yīng)機(jī)體內(nèi)的炎性應(yīng)激反應(yīng)。

目前的普遍觀點(diǎn)認(rèn)為炎癥性疾病，尤其是在可形成免疫復(fù)合物的疾病中(如HSP等)，組織的炎癥損傷反應(yīng)主要由補(bǔ)體系統(tǒng)的活化所介導(dǎo)〔6，7〕。有研究表明，活化的補(bǔ)體可產(chǎn)生過(guò)敏毒，進(jìn)而對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，并在細(xì)胞松弛素B作用下引起白細(xì)胞溶酶體酶釋放〔8〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)，抑制補(bǔ)體的活化或清除ROS均可有效緩解動(dòng)物皮膚動(dòng)脈血管炎的癥狀。更值得關(guān)注的是，補(bǔ)體活化片段還可以趨化中性粒細(xì)胞，并激活其發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放ROS〔9〕。本研究結(jié)果也提示補(bǔ)體系統(tǒng)在HSP發(fā)生過(guò)程中被活化，更為重要的是，筆者發(fā)現(xiàn)抑制了ROS的水平能夠減弱補(bǔ)體的活化程度，減輕炎癥反應(yīng)，表明補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了HSP的形成和進(jìn)展。

國(guó)外學(xué)者也曾報(bào)道，炎癥損傷過(guò)程中中性粒細(xì)胞的激活及其產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物是活化補(bǔ)體的一種重要方式，并且兩者之間存在相互促進(jìn)的反饋?zhàn)饔?，即炎性損傷過(guò)程中，補(bǔ)體活化誘發(fā)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)，而中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的自由基又可促進(jìn)補(bǔ)體的活化〔10，11〕。該反饋?zhàn)饔脴O可能是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及損傷的一個(gè)重要方式。此外，在器官和血管等炎癥發(fā)生時(shí)，腫瘤壞死因子、IL、TGF-β等炎性因子表達(dá)增加，而中性粒細(xì)胞也可大量產(chǎn)生上述因子，誘發(fā)組織損傷，并且這些因子還能反過(guò)來(lái)激活機(jī)體產(chǎn)生更多的中性粒細(xì)胞，形成惡性循環(huán)〔12〕。在補(bǔ)體活化的前提下，炎性因子還可刺激骨髓產(chǎn)生并釋放中性粒細(xì)胞，增加表面黏附分子的表達(dá)，加速中性粒細(xì)胞向組織侵入，誘導(dǎo)其發(fā)生呼吸爆發(fā)和脫顆粒，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物抑制因子，導(dǎo)致血管炎癥發(fā)生〔13，14〕。本研究通過(guò)構(gòu)建HSP動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體-中性粒細(xì)胞反饋的炎癥應(yīng)答調(diào)控在HSP的形成中具有重要作用，而且還采用了NAC和H2O2雙向調(diào)控ROS水平，從正反兩方面證實(shí)了干預(yù)ROS能夠抑制HSP的發(fā)生和進(jìn)展。

4參考文獻(xiàn)

1傅卓,任少敏,高曉峰,等.兒童過(guò)敏性紫癜早期腎損傷中VCAM-1的臨床意義〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014；14(6):1095-6,1100.

2Tayabali S,Andersen K,Yoong W.Diagnosis and management of henoch-schonlein purpura in pregnancy:a review of the literature〔J〕.Arch Gynecol Obstet,2012；286(4):825-9.

3Kiryluk K,Moldoveanu Z,Sanders JT,etal.Aberrant glycosylation of IgA1 is inherited in both pediatric IgA nephropathy and Henoch-Schonlein purpura nephritis〔J〕.Kidney Intern,2011；80(1):79-87.

4Jen HY,Chuang YH,Lin SC,etal.Increased serum interleukin-17 and peripheral Th17 cells in children with acute Henoch-Schonlein purpura〔J〕.Pediat Aller Immunol,2011；22(8):862-8.

5Park SJ,Suh JS,Lee JH,etal.Advances in our understanding of the pathogenesis of Henoch-Schonlein purpura and the implications for improving its diagnosis〔J〕.Expert Rev Clin Immunol,2013；9(12):1223-38.

6Tahan F,Dursun I,Poyrazoglu H,etal.The role of chemokines in Henoch Schonlein purpura 〔J〕.Rheumatol Intern,2007；27(10):955-60.

7McDonald B,Pittman K,Menezes GB,etal.Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation〔J〕.Science,2010；330(6002):362-6.

8Zipfel PF,Skerka C.Complement regulators and inhibitory proteins〔J〕.Nature Rev Immunol,2009；9(10):729-40.

9Mantovani A,Cassatella MA,Costantini C,etal.Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity〔J〕.Nature Rev Immunol,2011；11(8):519-31.

10Chou RC,Kim ND,Sadik CD,etal.Lipid-cytokine-chemokine cascade drives neutrophil recruitment in a murine model of inflammatory arthritis〔J〕.Immunity,2010；33(2):266-78.

11Phillipson M,Kubes P.The neutrophil in vascular inflammation〔J〕.Nature Med,2011；17(11):1381-90.

12Fox S,Leitch AE,Duffin R,etal.Neutrophil apoptosis:relevance to the innate immune response and inflammatory disease〔J〕.J Inn Immun,2010；2(3):216-27.

13Wang R,Lu B,Gerard C,etal.Disruption of the complement anaphylatoxin receptor C5L2 exacerbates inflammation in allergic contact dermatitis〔J〕.J Immunol,2013；191(8):4001-9.

14Zhang J,Koh J,Lu J,etal.Local inflammation induces complement crosstalk which amplifies the antimicrobial response〔J〕.PLoS Path,2009；5(1):e1000282.

〔2014-02-17修回〕

(編輯徐杰)