張 賀 盧俊瑞 穆江蓓 劉金彪 楊旭云 王美君 張瑞波(天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,天津300384)

3MBA類(lèi)FtsZ蛋白抑制劑的分子動(dòng)力學(xué)模擬及抗菌作用機(jī)制

張 賀 盧俊瑞*穆江蓓 劉金彪 楊旭云 王美君 張瑞波
(天津理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,天津300384)

采用分子動(dòng)力學(xué)模擬、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定(DSSP)、口袋體積測(cè)量(POVME)以及MM-PBSA (molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area)方法,系統(tǒng)研究了金黃色葡萄球菌絲狀溫度敏感性蛋白Z(SaFtsZ)-二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP)二元復(fù)合物和SaFtsZ-GDP-3MBA(3-甲氧基苯甲酰胺)類(lèi)衍生物三元復(fù)合物體系的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)構(gòu)象、關(guān)鍵殘基質(zhì)心距、活性口袋體積以及相對(duì)結(jié)合自由能的變化規(guī)律.研究表明:當(dāng)不含抑制劑存在時(shí)SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系穩(wěn)定性較差,其T7Loop區(qū)域殘基(203-209)波動(dòng)較大,且蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,活性口袋體積急劇減小,底物通道顯著變窄且不穩(wěn)定.而含有抑制劑PC190723、Compound1的類(lèi)衍生物三元復(fù)合物體系的表現(xiàn)截然不同,這主要是由于它們均能和活性口袋T7Loop區(qū)周?chē)鷼埢纬申P(guān)鍵性的氫鍵以及疏水作用,與FtsZ蛋白緊密結(jié)合.在SaFtsZ-GDP-3MBA三元復(fù)合物體系中,3MBA僅能與活性口袋中部分殘基形成疏水作用,與FtsZ蛋白親和力較弱,使其不能穩(wěn)定地存在于活性口袋中,進(jìn)一步導(dǎo)致它的抗菌活性明顯低于PC190723、Compound1.這些發(fā)現(xiàn)深入揭示了3MBA類(lèi)衍生物對(duì)FtsZ蛋白的作用機(jī)制和影響規(guī)律,為該類(lèi)FtsZ蛋白抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù).

3MBA類(lèi)衍生物;FtsZ;分子動(dòng)力學(xué)模擬;抗菌作用機(jī)制;結(jié)合自由能

1 引言

近年來(lái),抗生素濫用導(dǎo)致了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題,而已有抗菌藥物主要是針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成、核苷酸的合成、葉酸的合成等四類(lèi)靶標(biāo),致使現(xiàn)行抗菌藥物較易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性.解決上述問(wèn)題,迫切需要開(kāi)發(fā)具有新的作用靶點(diǎn)或新的作用機(jī)制的抗菌藥物.

近年來(lái),細(xì)菌分裂蛋白逐漸成為抗菌藥物研究的熱點(diǎn).1-3細(xì)菌分裂蛋白在形態(tài)上高度保守、不易變異.細(xì)菌細(xì)胞分裂過(guò)程中,FtsZ蛋白首尾相接,在細(xì)胞中央?yún)^(qū)域組裝聚合,形成與細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面鑲嵌的Z環(huán),最終以Z環(huán)為平面分裂成兩個(gè)子細(xì)胞.FtsZ作為起始蛋白,具有三磷酸鳥(niǎo)苷酶(GTPase)活性,能夠催化三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)水解生成二磷酸鳥(niǎo)苷(GDP),從而為Z環(huán)形成收縮和解聚提供能量.4-7研究表明,T7Loop附近區(qū)域是啟動(dòng)FtsZ蛋白組裝的關(guān)鍵開(kāi)關(guān),而組裝開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)必須要求C端序列區(qū)域殘基(223-310)向N端序列區(qū)域殘基(12-171)移動(dòng),并關(guān)閉兩區(qū)域之間的活性口袋通道.8如果能夠找到合適的化合物,有效阻斷FtsZ蛋白的組裝或抑制GTP酶的活性,就能夠?qū)е录?xì)菌的裂解死亡.6,9

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種不同骨架結(jié)構(gòu)的FtsZ抑制劑,按照其來(lái)源可分為天然化合物和全合成化合物兩類(lèi).天然化合物主要有綠垂曲霉(viriditoxin)、苯并啡啶堿類(lèi)生物堿血根堿(sanguinarine)、二萜酚(totarol)、白花丹素(plumbagin)、GTP類(lèi)似物Br-GTP等.10-16天然化合物往往因其生物利用度較差或體內(nèi)毒副作用較強(qiáng)等限制了它們的應(yīng)用.如綠垂毒素雖然對(duì)多重耐藥菌,如葡萄球菌屬、腸球菌屬、肺炎鏈球菌等具有較好的抗菌活性(MIC=2-32μg·mL-1),但其生物利用度存在不足,必須對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化,以提高其抗菌活性和靶向性.10全合成化合物主要通過(guò)高通量篩選、分子對(duì)接等方法尋找得到. 2005年Stokes等17從大約105000個(gè)化合物中篩選出活性化合物PC58538,并通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了代表性的化合物PC170942,其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為64μg·mL-1.2006年Ito等18從大約95000個(gè)化合物中篩選出活性化合物A-189,其對(duì)GTP酶的抑制活性(IC50)為80μg·mL-1,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為16μg·mL-1,研究表明其主要通過(guò)抑制GTP酶的活性來(lái)干擾FtsZ蛋白的組裝,從而抑制了細(xì)菌生長(zhǎng).2009年Beuria等19研究了29種骨架結(jié)構(gòu)的81個(gè)化合物對(duì)FtsZ蛋白組裝的影響,發(fā)現(xiàn)其中繞丹寧衍生物(OTBA)對(duì)FtsZ蛋白的特異性較強(qiáng),且對(duì)哺乳動(dòng)物的微管蛋白幾乎無(wú)抑制作用,其抑制枯草芽孢桿菌細(xì)胞增殖的MIC約為1μg·mL-1,是一種有潛力的先導(dǎo)化合物.迄今為止,在全合成化合物中3-甲氧基苯甲酰胺(3MBA)是公認(rèn)的最具開(kāi)發(fā)前景的先導(dǎo)化合物.早在1999年Ohashi等20便發(fā)現(xiàn)了3MBA能夠抑制枯草芽孢桿菌的二分裂,但抗菌活性較低,對(duì)金黃色葡萄球菌屬的MIC為4000μg· mL-1.2008年Haydon等21通過(guò)對(duì)3MBA衍生物修飾,得到了優(yōu)異的FtsZ靶向抑制劑PC190723 (9PC).研究表明,9PC能顯著抑制FtsZ蛋白的GTP酶活性,對(duì)GTP酶的IC50達(dá)到0.55μg·mL-1,對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC達(dá)到0.5-1μg· mL-1.為了驗(yàn)證其體內(nèi)活性,Haydon等21對(duì)腹腔接種潛在致死量金黃色葡萄球菌的小鼠樣本進(jìn)行皮下或靜脈注射30 mg·kg-1劑量的9PC溶液,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠存活率達(dá)到100%.2012年Stokes等22對(duì)3MBA衍生物進(jìn)行修飾,得到一種具有優(yōu)異體內(nèi)、外活性的化合物Compound 1(Com1),其在小鼠體內(nèi)的生物利用率達(dá)到82%.Com1對(duì)所有葡萄球菌屬的平均MIC達(dá)到0.12μg·mL-1,對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC達(dá)到0.03μg·mL-1,抗菌活性與抗菌藥物三氯生相近.23,24上述研究表明,3MBA作為FtsZ蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物具有突出優(yōu)勢(shì)和巨大潛力.圖1給出了3MBA及其典型衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu).

研究表明,抑制劑與FtsZ蛋白主要有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),即GTPase活性區(qū)域和T7Loop區(qū)的疏水性活性口袋.如天然產(chǎn)物綠垂霉素、Br-GTP均作用于GTPase活性區(qū)域,是GTP的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,但因抑制能力較弱,導(dǎo)致其抗菌活性相對(duì)較差.其余多數(shù)抑制劑,如3MBA、9PC、Com1等均作用于T7Loop的活性口袋區(qū)域.9PC具有2個(gè)獨(dú)特化學(xué)基團(tuán),即苯甲酰胺和噻唑并吡啶,能夠與FtsZ蛋白形成氫鍵及疏水等作用,而抑制劑在活性口袋中結(jié)合的穩(wěn)定性是決定其親和力以及靶向選擇性的關(guān)鍵因素.25在SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系中,9PC的酰胺基團(tuán)主要與FtsZ蛋白活性口袋上Val207、Asn263的羰基形成氫鍵,2-Cl基團(tuán)處于疏水殘基Leu200、Leu209附近,6-CL基團(tuán)處于疏水殘基Val203、Leu297附近.噻唑并吡啶能夠與H7螺旋區(qū)域和C端區(qū)域之間的殘基(Gly193,Gly196,Ile197,Met226, Ile228,Thr309等)形成疏水作用.這些結(jié)合模式均有利于三元復(fù)合物體系的形成和穩(wěn)定,構(gòu)成了9PC作為抑制劑的分子生物學(xué)基礎(chǔ).

圖1 3MBA及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of the 3MBAand its derivatives

盡管FtsZ蛋白已被公認(rèn)為是一種較好的抗菌藥物作用靶點(diǎn),而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)合成了一批FtsZ抑制劑,但因其體內(nèi)抗菌活性、作用機(jī)制等研究尚不夠深入,迄今,FtsZ蛋白抑制劑仍未進(jìn)入臨床應(yīng)用.因此,利用FtsZ蛋白晶體結(jié)構(gòu),研究抑制劑與FtsZ蛋白的結(jié)合模式和作用機(jī)制,對(duì)FtsZ蛋白抑制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義.本文以FtsZ蛋白晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ),應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定(DSSP)、口袋體積測(cè)量(POVME)以及MM-PBSA方法,對(duì)SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系及SaFtsZ-GDP-3MBA類(lèi)抑制劑三元復(fù)合物體系進(jìn)行研究,系統(tǒng)研究了T7Loop的疏水性活性口袋區(qū)域的穩(wěn)定性、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)構(gòu)象、關(guān)鍵殘基質(zhì)心距離,活性口袋體積以及相對(duì)結(jié)合自由能的特征和變化規(guī)律,揭示了3MBA類(lèi)抑制劑對(duì)細(xì)胞分裂蛋白FtsZ的內(nèi)在作用機(jī)制,為針對(duì)FtsZ靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)、篩選和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù).

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

從PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得代號(hào)為4DXD26的金黃色葡萄球菌FtsZ蛋白晶體結(jié)構(gòu),刪除晶體結(jié)構(gòu)中的水分子,建立SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系,刪除其中9PC的結(jié)構(gòu)信息建立SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系.通過(guò)AutoDock27分子對(duì)接獲得SaFtsZGDP-3MBA以及SaFtsZ-GDP-Com1三元復(fù)合物體系.在AutoDock對(duì)接中,盒子中心坐標(biāo)定義為晶體配體中醚氧原子的空間坐標(biāo)(x-center:-14.018;ycenter:42.480;z-center:18.071),格點(diǎn)間距為3.75× 10-2nm,盒子大小為50個(gè)格點(diǎn)組成的正方體區(qū)域.采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行計(jì)算,其運(yùn)行次數(shù)設(shè)置為200次,最大能量評(píng)估次數(shù)設(shè)置為2.5×106,最多迭代次數(shù)設(shè)置為2.7×105,其他參數(shù)為默認(rèn)值.使用acpype程序28生成配體及GDP的拓?fù)湮募?用于構(gòu)建分子動(dòng)力學(xué)模擬中的復(fù)合物拓?fù)湮募?

為了深入認(rèn)識(shí)抑制劑對(duì)FtsZ蛋白的作用機(jī)制,通過(guò)ZDOCK 3.0.2程序29進(jìn)行蛋白與蛋白全局剛性對(duì)接采集SaFtsZ蛋白二聚體結(jié)構(gòu),對(duì)接產(chǎn)生2000個(gè)二聚體結(jié)構(gòu).之后對(duì)所有結(jié)構(gòu)進(jìn)行打分排序,從中挑選出打分較好并且滿(mǎn)足結(jié)合位點(diǎn)信息的結(jié)構(gòu)用于結(jié)果分析,并與晶體結(jié)構(gòu)中詹氏甲烷球菌MjFtsZ-GTP二聚體(PDB代號(hào)為1W5A)的構(gòu)象對(duì)比.

2.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

運(yùn)用Gromacs 4.6.4分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件,30在Amber ff99SB力場(chǎng)31下,分別對(duì)上述四種復(fù)合物體系進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬.體系質(zhì)心均位于截角八面體盒子中心,溶質(zhì)外圍加上1.0 nm的TIP3P模型32的水分子層.首先用最陡下降法對(duì)復(fù)合物進(jìn)行50000步的能量?jī)?yōu)化,以消除分子間的高能碰撞,然后分別進(jìn)行100 ps的NVT和100 ps的NPT模擬,使體系溫度保持在300 K、壓強(qiáng)保持在105Pa左右的平衡狀態(tài),最后分別對(duì)四種復(fù)合物體系進(jìn)行100 ns無(wú)約束的分子動(dòng)力學(xué)模擬.采用周期性邊界條件和PME(Particle Mesh Ewald)方法處理長(zhǎng)程靜電作用.通過(guò)V-rescale和Parrinello-Rahman控制系統(tǒng)的溫度和壓力.33,34使用LINCS算法35固定所有成鍵原子之間的相對(duì)距離.模擬過(guò)程中采用的積分步長(zhǎng)為2 fs,每5步更新一次非鍵連接表,每1 ps保存一次軌跡結(jié)構(gòu)用于后續(xù)數(shù)據(jù)的分析.36

所有計(jì)算機(jī)模擬工作均在HP Z820工作站上完成,主要配置:CPU為Intel(R)Xeon(R)E5-2680@ 2.7 GHz,內(nèi)存為64 GB,硬盤(pán)為2 T,配有GPU (NVIDIATesla C2075)加速計(jì)算顯卡.

2.3 T7Loop區(qū)活性口袋體積測(cè)定

分別從四種體系100 ns的分子動(dòng)力學(xué)軌跡文件中每隔50 ps提取一幀復(fù)合物坐標(biāo)文件.將提取的2000個(gè)坐標(biāo)文件與初始坐標(biāo)文件進(jìn)行疊加,采用POVME程序37對(duì)每幀疊加之后的蛋白進(jìn)行活性口袋體積計(jì)算.以9PC中的醚氧原子的空間位置(-14.018,42.480,18.071)為中心坐標(biāo),以1.0 nm為半徑構(gòu)建球體,使球體包含整個(gè)活性口袋.使用POVME程序生成半徑為0.1 nm的體積-格點(diǎn)文件,刪除與氨基酸殘基相疊合的格點(diǎn),同時(shí)保留以中心坐標(biāo)為球心,半徑0.4 nm范圍內(nèi)缺失不多于2個(gè)的連續(xù)格點(diǎn).38最后根據(jù)格點(diǎn)的數(shù)量計(jì)算得到活性口袋體積隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)圖.

2.4 結(jié)合自由能計(jì)算

從分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中得到的配體與受體蛋白的相對(duì)結(jié)合自由能通常比分子對(duì)接得分具有更高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性以及篩選能力.通過(guò)g_mmpbsa工具運(yùn)用MM-PBSA方法計(jì)算得到配體與FtsZ蛋白之間的相對(duì)結(jié)合自由能G.G=EMM+Gsolv,其中EMM=Gele+Gvdw,Gsolv=Gpolar+Gnon-polar.相對(duì)結(jié)合自由能計(jì)算中忽略了熵的變化.其中Gele為靜電作用, Gvdw為范德華力,Gsolv為溶劑化作用,Gpolar為極性溶劑化作用,Gnon-polar為非極性溶劑化作用.極性和非極性項(xiàng)的計(jì)算則采用APBS軟件,39電性項(xiàng)的參數(shù)gridspacing取0.05 nm,探針半徑0.14 nm,復(fù)合物介電常數(shù)設(shè)為1,溶劑的介電常數(shù)設(shè)為80.非極性項(xiàng)Gnon-polar采用溶劑可及表面(SASA)模型計(jì)算:Gnon-polar= γSSASA+β.其中γ為表面張力參數(shù),β為擬合修正參數(shù), γ=2.27 kJ·mol-1·nm-2,β=3.85 kJ·mol-1.34,40相對(duì)結(jié)合自由能值為從分子動(dòng)力學(xué)模擬最后10 ns軌跡中每隔100 ps獲得構(gòu)象的平均結(jié)合自由能.配體與FtsZ蛋白的相對(duì)結(jié)合自由能反映了配體與蛋白結(jié)合能力的強(qiáng)弱,決定了配體能否穩(wěn)定存在于活性口袋中.而配體與活性位點(diǎn)結(jié)合的穩(wěn)定性往往是決定抑制劑親和力以及靶向選擇性的關(guān)鍵因素.

3 結(jié)果分析與討論

3.1 MjFtsZ二聚體和SaFtsZ二聚體結(jié)合模式

如圖2所示,A代表詹氏甲烷球菌MjFtsZ-GTP二聚體構(gòu)象,B代表金黃色葡萄球菌SaFtsZ-GDP-9PC復(fù)合物體系二聚體構(gòu)象.在MjFtsZ-GTP二聚體構(gòu)象中,FtsZ蛋白首尾相接,FtsZ蛋白的Loop區(qū)嵌入到另一個(gè)FtsZ蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)域,行使催化功能,水解GTP轉(zhuǎn)化為GDP,為細(xì)菌分裂提供能量.在SaFtsZ-GDP-9PC復(fù)合物體系二聚體構(gòu)象中,蛋白構(gòu)象與圖2A相似,T7Loop區(qū)與另一個(gè)FtsZ蛋白的核苷酸結(jié)合區(qū)域靠近,配體9PC存在于T7Loop區(qū)周?chē)幕钚钥诖?能夠穩(wěn)定FtsZ蛋白構(gòu)象.

圖2 MjFtsZ蛋白二聚體和SaFtsZ蛋白二聚體構(gòu)象Fig.2 Conformations of MjFtsZ protein dimer and SaFtsZ protein dimer

3.2 四種體系的穩(wěn)定性與殘基波動(dòng)情況

對(duì)四種體系分別進(jìn)行100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬.以晶體初始蛋白構(gòu)象為參照,分析蛋白中Cα原子的均方根偏差(RMSD)隨模擬時(shí)間變化趨勢(shì),考察四種體系蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性以及殘基波動(dòng)情況.從圖3中可知,二元復(fù)合物的RMSD值在30 ns左右達(dá)最大值后逐漸平衡,平衡后RMSD值在0.180-0.297 nm之間,RMSD平均值為0.223 nm,SaFtsZGDP-3MBA體系在前60 ns其RMSD值不斷升高,隨后逐漸平衡,平衡后RMSD值為0.190-0.300 nm, RMSD平均值為0.238 nm,兩種體系與初始蛋白晶體構(gòu)象相比變化幅度較大.SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系在10 ns后已達(dá)到平衡,平衡后RMSD值在0.098-0.209 nm區(qū)間內(nèi)變化,RMSD平均值僅為0.149 nm.SaFtsZ-GDP-Com1三元復(fù)合物體系在30 ns左右達(dá)到平衡,平衡后的RMSD值為0.120-0.227 nm,RMSD平均值僅為0.163 nm.配體9PC、Com1的存在使蛋白構(gòu)象變化與整體變化幅度均較小.這主要是因?yàn)?PC或Com1能夠穩(wěn)定FtsZ蛋白的整體構(gòu)象,使其能夠較好地保持初始蛋白構(gòu)象.

為研究FtsZ蛋白氨基酸殘基的波動(dòng)情況,分別計(jì)算四種體系在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中氨基酸殘基的均方根漲落值(RMSF).如圖4所示,二元復(fù)合物中所有殘基的平均RMSF值為0.111 nm,在3MBA、9PC、Com1存在的三元復(fù)合物中所有殘基的平均RMSF值分別為0.123、0.110、0.110 nm,四種體系氨基酸殘基RMSF值較為相近,氨基酸殘基整體波動(dòng)情況較為一致,但在SaFtsZ-GDP-3MBA體系中部分氨基酸殘基波動(dòng)明顯.為此深入研究四種體系RMSF值差異性較大的區(qū)域,對(duì)T7Loop區(qū)域以及H7螺旋區(qū)域(Met179-Ala202)進(jìn)行進(jìn)一步分析.發(fā)現(xiàn)當(dāng)9PC、Com1存在時(shí)活性口袋T7Loop區(qū)殘基RMSF值波動(dòng)較小,平均值分別僅為0.094、0.117 nm,表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性.而3MBA存在的三元復(fù)合物或無(wú)配體的二元復(fù)合物體系中,T7Loop區(qū)殘基的RMSF值波動(dòng)較大,平均值分別為0.243、0.123 nm,相對(duì)于其他兩個(gè)三元復(fù)合物體系的T7Loop區(qū)殘基表現(xiàn)出較大的波動(dòng)性.對(duì)H7螺旋區(qū)域殘基RMSF值進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),在配體3MBA、9PC、Com1存在時(shí)RMSF平均值分別為0.152、0.129、0.147 nm,而無(wú)配體存在時(shí)H7螺旋區(qū)域殘基的RMSF平均值僅為0.102 nm.配體的存在反而使得H7螺旋區(qū)域殘基有較大的浮動(dòng),配體對(duì)這一區(qū)域殘基RMSF值的影響導(dǎo)致三元復(fù)合物體系所有殘基的RMSF平均值與二元復(fù)合物體系所有殘基的RMSF平均值較為相近.以上數(shù)據(jù)表明,當(dāng)9PC、Com1存在時(shí)能夠降低T7Loop區(qū)殘基的柔性,使得靠近苯甲酰胺基團(tuán)的活性口袋區(qū)域構(gòu)成一個(gè)較為穩(wěn)定的體系.這主要是由于苯甲酰胺基團(tuán)能夠和T7Loop區(qū)殘基形成較強(qiáng)的氫鍵以及疏水作用,使其靶向作用于這一活性口袋區(qū)域.

圖3 四種體系Cα相對(duì)于晶體結(jié)構(gòu)位置的均方根偏差隨模擬時(shí)間的變化Fig.3 Alpha-carbon root mean square deviations(RMSD) of the four models relative to the crystal structure,as a function of time

圖4 動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中蛋白各個(gè)殘基的均方根漲落Fig.4 Root mean square fluctuations(RMSF)of residues in the protein during dynamics simulations

圖5 Met179-Ala202殘基二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間的變化Fig.5 Secondary structure changes of the Met179-Ala202 residues as a function of time

3.3 四種體系中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況

通過(guò)DSSP程序41計(jì)算四種體系蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化的規(guī)律,發(fā)現(xiàn)主要變化集中在T7Loop區(qū)域以及H7螺旋區(qū)域.二元復(fù)合物體系T7Loop區(qū)中Ser204-Gly205殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)為coil卷曲,然而隨著模擬的進(jìn)行,主要在coil卷角、bend彎曲之間相互轉(zhuǎn)化,最終以bend彎曲形式穩(wěn)定存在.三元復(fù)合物中除3MBA體系外該區(qū)域以coil卷曲形式穩(wěn)定存在.3MBA體系該區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)隨著模擬的進(jìn)行,在coil卷角、bend彎曲、turn轉(zhuǎn)角之間不斷轉(zhuǎn)化.

圖5所示為二元復(fù)合物體系與典型的SaFtsZGDP-9PC三元復(fù)合物體系H7螺旋區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)隨模擬時(shí)間變化的情況.在模擬初期,SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系中H7螺旋區(qū)域中Gln195-Ala202殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)為α螺旋,隨著模擬的進(jìn)行該區(qū)域二級(jí)結(jié)構(gòu)在310螺旋、α螺旋、turn轉(zhuǎn)角之間轉(zhuǎn)化,最終二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以turn轉(zhuǎn)角形式存在.H7螺旋區(qū)域中Ala182-Glu185殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)在310螺旋、α螺旋、turn轉(zhuǎn)角之間轉(zhuǎn)化,平衡之后以310螺旋穩(wěn)定存在.而在SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系中Gln195-Ala202殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象較為單一穩(wěn)定,主要以α螺旋規(guī)則構(gòu)象存在,僅觀察到T7Loop區(qū)與H7螺旋區(qū)連接處殘基Leu200-Ala202二級(jí)結(jié)構(gòu)在α螺旋、turn轉(zhuǎn)角之間不斷轉(zhuǎn)化,最終主要以turn轉(zhuǎn)角形式存在.H7螺旋區(qū)域中Ala182-Asp187殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)從35 ns左右開(kāi)始在310螺旋、α螺旋、turn轉(zhuǎn)角之間不斷轉(zhuǎn)化.可見(jiàn),配體的存在能夠較好地穩(wěn)定T7Loop區(qū)域殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu),但同時(shí)引起了H7螺旋區(qū)域Ala182-Asp187殘基二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化.

3.4 T7Loop區(qū)活性口袋與配體的結(jié)合模式

為了更清晰地描述3MBA類(lèi)衍生物與活性口袋關(guān)鍵殘基的相互作用,通過(guò)對(duì)四種體系最后10 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡進(jìn)行聚類(lèi)分析,分別得到四種體系具有代表性的構(gòu)象.在聚類(lèi)分析過(guò)程中,基于所有原子的RMSD,應(yīng)用gromos計(jì)算方法提取構(gòu)象類(lèi)似的幀為一類(lèi),選取最大類(lèi)的構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合模式的分析.應(yīng)用Pymol程序42和LigPlot+軟件43和對(duì)三元復(fù)合物體系進(jìn)行結(jié)合模式的分析,如圖6所示, 3MBA并沒(méi)有與FtsZ蛋白形成氫鍵作用,僅僅與活性口袋兩側(cè)部分殘基形成疏水作用.而9PC、Com1不僅能夠與T7Loop區(qū)Gly205、Val207或Leu209殘基形成氫鍵作用,而且均能與活性口袋一側(cè)Asn263殘基形成關(guān)鍵的氫鍵作用,同時(shí)與活性口袋區(qū)域中的Gly193、Gly196、Leu200、Thr309等殘基形成疏水作用.在最后10 ns代表性構(gòu)象中三元體系配體3MBA、9PC、Com1與初始配體構(gòu)象的RMSD值分別為1.03、0.16、0.300 nm.可見(jiàn)配體9PC和Com1均能較好地保持初始構(gòu)象,而配體3MBA構(gòu)象變化極大.通過(guò)與初始構(gòu)象結(jié)合模式進(jìn)一步對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在初始構(gòu)象中9PC、Com1均能與Gly205、Val207或Leu209殘基形成氫鍵作用.其中在初始構(gòu)象中Com1并沒(méi)有和Asn263殘基形成氫鍵作用.然而在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中,通過(guò)分子構(gòu)象的不斷變化,Com1與Asn263殘基形成氫鍵并穩(wěn)定存在. 3MBA雖然在初始蛋白構(gòu)象能夠與Gly205、Val207、Leu209、Asn263殘基形成氫鍵作用,但與其形成疏水作用的殘基相對(duì)較少,導(dǎo)致疏水作用較弱,影響3MBA在活性口袋的穩(wěn)定性,隨著模擬時(shí)間的進(jìn)行,氫鍵作用逐漸消失,3MBA逐漸遠(yuǎn)離活性口袋區(qū)域.

圖6 最后10 ns中三種體系代表構(gòu)象結(jié)合模式圖Fig.6 Representative binding modes of the three models during the last 10 ns

3.5 T7Loop區(qū)活性口袋關(guān)鍵殘基質(zhì)心距離

T7Loop區(qū)活性口袋形狀類(lèi)似于狹長(zhǎng)的通道,抑制劑進(jìn)入活性口袋后占據(jù)底物通道,使得活性口袋區(qū)域保持較為穩(wěn)定的構(gòu)象.為了更清晰地描述底物通道的變化,通過(guò)測(cè)量四種體系T7Loop區(qū)周?chē)鶯eu200殘基與Asn263殘基之間的質(zhì)心距,考察活性口袋通道兩側(cè)距離隨模擬時(shí)間的變化.表1所示為四種體系Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距的初始距離、最小距離、最大距離以及平均距離.圖7所示為SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系以及選取的SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系中Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距隨模擬時(shí)間的變化曲線(xiàn).在二元復(fù)合物體系中,Leu200殘基與Asn263殘基初始質(zhì)心距為0.787 nm,在模擬初期0.2 ns左右達(dá)最大值(0.951 nm),隨著時(shí)間的增加質(zhì)心距逐漸變小,在26 ns左右達(dá)到最小值(0.504 nm),之后逐漸穩(wěn)定,模擬過(guò)程中質(zhì)心距平均值僅為0.651 nm,而在SaFtsZGDP-9PC三元復(fù)合物體系中,Leu200殘基與Asn263殘基初始質(zhì)心距為0.822 nm,隨模擬時(shí)間波動(dòng)較小,在1.2 ns左右達(dá)最大值1.037 nm,最小值僅為0.775 nm,模擬過(guò)程中質(zhì)心距平均值為0.853 nm,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二元復(fù)合物的質(zhì)心距相對(duì)應(yīng)值,這些數(shù)據(jù)表明FtsZ活性口袋區(qū)域底物通道殘基具有較高的柔性,無(wú)配體存在的二元復(fù)合物體系中活性口袋通道距離變窄.而配體9PC、Com1的存在能夠穩(wěn)定活性口袋通道,較好地保持初始蛋白構(gòu)象,Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距較初始距離稍微增加,導(dǎo)致底物通道距離變寬.SaFtsZ-GDP-Com1三元復(fù)合物體系Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距的相對(duì)應(yīng)值均稍高于SaFtsZ-GDP-9PC三元復(fù)合物體系.而SaFtsZ-GDP-3MBA三元復(fù)合物體系中配體的存在并沒(méi)有對(duì)質(zhì)心距造成很大的影響.在分子動(dòng)力學(xué)模擬初期,配體3MBA的存在一定程度上穩(wěn)定了底物通道,但隨著模擬時(shí)間的進(jìn)行,可以看出Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距和二元復(fù)合物體系質(zhì)心距趨勢(shì)類(lèi)似,僅僅比二元復(fù)合物體系質(zhì)心距平均值高0.017 nm,可見(jiàn)3MBA并不能很好的穩(wěn)定存在于活性口袋中.

表1 氨基酸Leu200與Asn263質(zhì)心距特征值Table 1 Eigenvalues of center-of-mass distance between residues Leu200 andAsn263

圖7 Leu200殘基與Asn263殘基之間的質(zhì)心距離隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)Fig.7 Center-of-mass distance between residues Leu200 andAsn263 as a function of time

3.6 T7Loop區(qū)活性口袋體積分析

活性口袋體積隨模擬時(shí)間變化的規(guī)律如圖8所示,SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系活性口袋體積隨著模擬時(shí)間迅速減小,波動(dòng)范圍較廣,體積在0-0.197 nm3區(qū)間上下波動(dòng),后60 ns體積平均僅為0.016 nm3,而三元復(fù)合物的體積變化較小,以SaFtsZGDP-9PC三元復(fù)合物體系為例,模擬平衡后,活性口袋體積變化較小,以平均體積0.399 nm3保持穩(wěn)定存在.而在SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系中,底物通道距離變窄,活性口袋體積呈顯著性縮小變化.這主要是由于在9PC體系中,9PC既能與Val207、Asn263等殘基形成氫鍵,又能與活性口袋中Gly193、Leu200、Val203、Leu209、Thr309等殘基形成疏水作用,從而穩(wěn)定存在于活性口袋中.與9PC體系比較,Com1體系活性口袋體積變化較為類(lèi)似,而配體3MBA存在時(shí),體系的活性口袋體積變化明顯,平均活性口袋體積則介于9PC體系和二元體系之間.

圖8 四種體系中活性口袋體積隨時(shí)間的變化Fig.8 Volumes of the active pockets of the four models as a function of time

由于T7Loop區(qū)附近區(qū)域是啟動(dòng)FtsZ蛋白組裝的開(kāi)關(guān),而組裝開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)必須要求C端序列移向N端序列并關(guān)閉兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的狹長(zhǎng)活性口袋區(qū)域.在9PC、Com1存在時(shí),兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中Leu200殘基與Asn263殘基質(zhì)心距較初始質(zhì)心距增加,同時(shí)活性口袋體積波動(dòng)較小,能夠較好地保持初始蛋白構(gòu)象,進(jìn)一步表現(xiàn)為阻礙C端序列移向N端序列,使FtsZ蛋白組裝開(kāi)關(guān)呈關(guān)閉狀態(tài),進(jìn)而影響細(xì)菌分裂.

3.7 MM-PBSA相對(duì)結(jié)合自由能分析

通過(guò)MM-PBSA方法計(jì)算SaFtsZ-GDP-3MBA、SaFtsZ-GDP-9PC、SaFtsZ-GDP-Com1體系相對(duì)結(jié)合自由能Gbinding大小依次為-62.85,-157.19,-199.27 kJ·mol-1.配體9PC、Com1與FtsZ蛋白的相對(duì)結(jié)合自由能均小于-150 kJ·mol-1,結(jié)合能值是衡量配體是否能夠穩(wěn)定存在于活性口袋的重要指標(biāo),較低的結(jié)合能使得配體與FtsZ蛋白能夠較好的結(jié)合.與9PC和Com1相比,3MBA與FtsZ蛋白相對(duì)結(jié)合自由能較高,僅為-62.85 kJ·mol-1,因此3MBA雖然在模擬初期能夠與FtsZ蛋白形成氫鍵以及疏水作用,但由于結(jié)合能力相對(duì)較弱,隨著分子動(dòng)力學(xué)模擬的進(jìn)行,3MBA并不能很好地穩(wěn)定存在于活性口袋中.這與以上研究結(jié)果中Leu200和Asn263殘基質(zhì)心距變化,T7Loop區(qū)域活性口袋體積變化是一致的.同樣生物活性測(cè)試結(jié)果中3MBA、9PC、Com1對(duì)金黃色葡萄球菌屬的MIC值分別為4000、0.5-1、0.12μg· mL-1.AutoDock分子對(duì)接中3MBA、9PC、Com1的結(jié)合能分別為-27.00、-42.11、-43.70 kJ·mol-1.可見(jiàn)MM-PBSA相對(duì)結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果與生物活性測(cè)試結(jié)果以及AutoDock分子對(duì)接結(jié)果反映的規(guī)律相一致.

為進(jìn)一步分析相對(duì)結(jié)合自由能中不同結(jié)合能的貢獻(xiàn),對(duì)三種配體與FtsZ蛋白的分項(xiàng)結(jié)合自由能進(jìn)行比較,結(jié)果如表2所示.

從表2中可以看出,范德華作用對(duì)相對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)最為突出,然后依次是靜電作用和非溶劑化作用.在形成復(fù)合物的過(guò)程中,范德華作用、非極性溶劑化能和靜電作用均有利于配體的結(jié)合,而溶劑化能為正值,不利于配體的結(jié)合.這主要是由于溶質(zhì)分子在進(jìn)入溶劑后要排開(kāi)一部分溶劑,同時(shí)阻斷溶劑分子之間的相互作用,這個(gè)過(guò)程是熱力學(xué)不利的.

為了更進(jìn)一步考察配體與FtsZ蛋白分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中各部分殘基對(duì)相對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn),通過(guò)自由能分解得出各個(gè)殘基對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn).為方便分析,將結(jié)合能分成＞-2 kJ·mol-1、-2--4 kJ·mol-1、-4--6 kJ·mol-1、＜-6 kJ·mol-1四級(jí).表3列出了三元復(fù)合物體系在結(jié)合過(guò)程中主要?dú)埢鶎?duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn).

表2 三種配體與FtsZ蛋白的分項(xiàng)結(jié)合自由能Table 2 Partial binding energy of three ligands with FtsZ protein

表3 主要?dú)埢鶎?duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)Table 3 Binding energy contributions of some main residues

從表3中可以看出,SaFtsZ-GDP-3MBA三元復(fù)合物體系中,僅有Glu301、Leu302、Val307三個(gè)殘基與3MBA形成較強(qiáng)的相互作用能.而9PC、Com1存在的三元體系中,T7Loop區(qū)域周?chē)鷼埢鏏sp199、Leu200、Leu209均能與配體形成很強(qiáng)的相互作用能.尤其是SaFtsZ-GDP-Com1三元復(fù)合物體系,能夠與配體形成＜-6.0 kJ·mol-1的殘基有Ile197、Ile311、Asp199、Leu200.其中Leu200與配體的相互作用能最低,僅為-8.89 kJ·mol-1,這對(duì)Com1能夠穩(wěn)定存在于活性口袋的貢獻(xiàn)是巨大的.

4 結(jié)論

應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬以及相關(guān)計(jì)算方法研究了3MBA類(lèi)衍生物與金黃色葡萄球菌FtsZ蛋白T7Loop區(qū)周?chē)钚钥诖淖饔靡?guī)律.研究表明,在分子動(dòng)力學(xué)模擬中,SaFtsZ-GDP二元復(fù)合物體系和抑制劑存在的三元復(fù)合物體系均能形成低能的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài).與二元體系和3MBA三元體系相比,配體9PC、Com1存在的三元復(fù)合物體系中,9PC、Com1均能夠限制FtsZ蛋白的構(gòu)象,同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵殘基質(zhì)心距、活性口袋體積的變化起到關(guān)鍵性的控制作用,使T7Loop區(qū)底物通道保持穩(wěn)定存在,表現(xiàn)為C端序列不能移向N端序列, FtsZ蛋白組裝開(kāi)關(guān)呈關(guān)閉狀態(tài).主要原因是9PC、 Com1既能與Val207、Leu209、Asn263等殘基形成氫鍵,又能與活性口袋中Gly193、Gly196、Leu200、Thr309等殘基形成關(guān)鍵性的疏水作用,從而穩(wěn)定存在于活性口袋.而3MBA與FtsZ蛋白形成疏水作用的殘基相對(duì)較少,因此疏水作用較弱,影響3MBA在活性口袋的穩(wěn)定性,隨著模擬時(shí)間的延長(zhǎng),3MBA逐漸遠(yuǎn)離活性口袋區(qū)域.對(duì)三種配體的生物活性測(cè)試結(jié)果、分子對(duì)接結(jié)果以及MM-PBSA相對(duì)結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),三種實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映的規(guī)律相一致.上述研究結(jié)果為深入認(rèn)識(shí)抑制劑對(duì)FtsZ蛋白的抗菌作用機(jī)制,以及以FtsZ蛋白為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)、篩選和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了重要的理論依據(jù).

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Molecular Dynamics Simulation and Antibacterial Mechanism of 3MBA Derivatives as FtsZ Protein Inhibitors

ZHANG He LU Jun-Rui*MU Jiang-Bei LIU Jin-Biao YANG Xu-Yun WANG Mei-Jun ZHANG Rui-Bo
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Tianjin University of Technology,Tianjin 300384,P.R.China)

In this paper,the complex stability,secondary structure,protein conformation,residue distance, active site volume,and binding free energy of the binary complex of filamentous sensitivity division protein Z of Staphylococcus aureus-guanosine diphosphate(SaFtsZ-GDP)and the ternary complex of SaFtsZ-GDP-3MBA(3-methoxybenzamide)derivatives were studied using molecular dynamics simulations,definition of secondary structure of proteins(DSSP),pocket volume measurer(POVME),and the molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area(MM-PBSA)method.The results show that the SaFtsZ-GDP binary complex was unstable in the absence of inhibitor,and the residues of its T7Loop area(residues 203-209)show obvious fluctuations.The secondary structure of the protein in the T7Loop area also changes significantly,the active pocket volume decreases dramatically and the substrate channel size becomes narrow and unstable.However, the SaFtsZ-GDP-3MBA derivatives ternary complex looks completely different in the presence of inhibitor PC190723 or Compound 1.Both of the inhibitors can form hydrogen bonds and hydrophobic interactions with high affinity to FtsZ.However,the ligand only forms hydrophobic interactions with partial residues of the active site as a function of simulation time in the SaFtsZ-GDP-3MBA ternary complex.This low affinity means that3MBAcannot stably exist in the active site,and so the antibacterial activity of 3MBAis significantly lower than that of PC190723 or Compound 1.The study shows the antibacterial mechanism and effect of 3MBAderivatives on FtsZ,and provides an important theoretical basis for inhibitor structural optimization,development and applications.?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

3-MBAderivative;FtsZ;Molecular dynamics simulation;Antibacterial mechanism; Binding free energy

O641

10.3866/PKU.WHXB201501061www.whxb.pku.edu.cn

Received:October 27,2014;Revised:January 6,2015;Published on Web:January 6,2015.

?Corresponding author.Email:lujunrui@tjut.edu.cn;Tel:+86-22-60216638.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(21476174,21176194).

國(guó)家自然科學(xué)基金(21476174,21176194)資助項(xiàng)目