（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009）

α－淀粉酶（α－1，4－葡聚糖－4－葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1）屬于內(nèi)切酶，它能作用于淀粉分子內(nèi)部的α－1，4糖苷鍵，將其水解成糊精、麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等［1］。α－淀粉酶作為酶制劑的重要組成部分，占酶制劑市場(chǎng)約25%的份額，廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、紡織、造紙、制藥以及臨床醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域［2］。伴隨國(guó)內(nèi)外淀粉加工業(yè)的不斷發(fā)展，α－淀粉酶的應(yīng)用范圍還在不斷擴(kuò)大［2］。因此，篩選高產(chǎn)α－淀粉酶菌株已成為酶制劑研究領(lǐng)域的重要方向。

野生菌株因產(chǎn)率低、性能差而不能直接用于工業(yè)化生產(chǎn)，需要通過(guò)菌種誘變選育出高產(chǎn)優(yōu)良菌株［3－7］。不同的誘變方法對(duì)菌株會(huì)產(chǎn)生不同的突變效應(yīng)，如紫外誘變可使DNA 形成嘧啶二聚體，氯化鋰誘變可使AT－GC堿基對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)換或?qū)е聣A基缺失［8－9］。單一誘變方法雖可得到高產(chǎn)菌侏，但幾率偏低；復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，比單一誘變效果好［10］。鑒于此，作者在此采用紫外－氯化鋰對(duì)枯草芽孢桿菌BL01 進(jìn)行復(fù)合誘變，以期得到高產(chǎn)α－淀粉酶菌株，對(duì)誘變條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌BL01，自行篩選保藏。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g·L－1，酵母提取物5g·L－1，氯化鈉10g·L－1，pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需加入20g·L－1的瓊脂；篩選培養(yǎng)基需加入1%可溶性淀粉；氯化鋰平板培養(yǎng)基需加入一定濃度的氯化鋰。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉60g·L－1，豆餅粉30g·L－1，（NH4）2SO45g·L－1，Na2HPO4·12H2O 5g·L－1，MgSO4·7H2O 0.1g·L－1，NaCl 0.1g·L－1，pH 值7.0，121 ℃滅菌20min。

1.2 培養(yǎng)條件

斜面／平板培養(yǎng)：37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d。

種子液培養(yǎng)：挑單菌落接種到30 mL LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h。

發(fā)酵液培養(yǎng)：搖瓶裝量50 mL·（500 mL）－1，接種量2%，于37 ℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)96h。

1.3 誘變方法

1.3.1 菌懸液的制備

從平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r·min－1搖床培養(yǎng)12h，用生理鹽水稀釋至10－5數(shù)量級(jí)，即得菌懸液。

1.3.2 紫外誘變

取5mL菌懸液于直徑為9cm 的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，待用。打開(kāi)紫外燈，預(yù)熱20min，待光波穩(wěn)定后，將無(wú)菌培養(yǎng)皿放置在距紫外燈垂直距離20cm 處，開(kāi)啟磁力攪拌，分別照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，于37 ℃避光培養(yǎng)。以未經(jīng)處理的菌懸液為對(duì)照組。挑取20個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，按式（1）、（2）計(jì)算致死率與正突變率。

1.3.3 氯化鋰誘變

取0.1mL菌懸液均勻涂布于含濃度梯度為0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的氯化鋰平板培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)20h。其中0%為對(duì)照組。挑取20個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，按式（1）、（2）計(jì)算致死率與正突變率。

1.3.4 紫外－氯化鋰復(fù)合誘變

將菌懸液先經(jīng)紫外照射一段時(shí)間后，再涂布在含一定濃度的氯化鋰平板培養(yǎng)基上，37 ℃避光培養(yǎng)。挑取30個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，按式（1）、（2）計(jì)算致死率與正突變率。

1.4 篩選方法

1.4.1 初篩

將誘變后的菌液涂布于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑，并計(jì)算其比值（HC 值），將HC值較大的單菌落保存于斜面培養(yǎng)基，以備復(fù)篩。

1.4.2 復(fù)篩

將初篩獲得的菌株先進(jìn)行種子液培養(yǎng)，再進(jìn)行發(fā)酵液培養(yǎng)，取上清，按QB／T 1803－93方法測(cè)定α－淀粉酶酶活。

酶活定義：將1mL液體酶在pH 值為6.0、60 ℃下，1h液化1g可溶性淀粉定義為一個(gè)酶活單位（U·mL－1）。

1.5 遺傳穩(wěn)定性研究

將出發(fā)菌株與復(fù)篩得到的高產(chǎn)菌株各連續(xù)傳代5代，每代重復(fù)3次，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200r·min－1搖瓶培養(yǎng)96h后，離心，取上清，測(cè)定α－淀粉酶酶活，考察高產(chǎn)菌株傳代后產(chǎn)α－淀粉酶能力的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外照射時(shí)間的選擇（圖1）

由圖1可看出：隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高、正突變率先升高后略微降低；當(dāng)紫外照射時(shí)間為150s時(shí)，致死率達(dá)到90.4%，正突變率達(dá)到最高值25.0%；酶活提高10%以上的菌株有4株。因此，選擇最佳紫外照射時(shí)間為150s較為適宜。

2.2 氯化鋰濃度的選擇（圖2）

圖1 紫外誘變的致死率與正突變率Fig.1 Death rate and positive mutation rate of UV mutation

圖2 氯化鋰誘變的致死率與正突變率Fig.2 Death rate and positive mutation rate of LiCl mutation

由圖2可看出：隨著氯化鋰濃度的增大，致死率逐漸升高、正突變率逐漸降低；當(dāng)氯化鋰濃度為0.3%時(shí)，致死率為49.2%，正突變率最大，為19.4%；酶活提高10%以上的菌株有3株。因此，選擇氯化鋰濃度為0.3%較為適宜。

2.3 紫外－氯化鋰復(fù)合誘變

在紫外照射時(shí)間為150s、氯化鋰濃度為0.3%的條件下進(jìn)行紫外－氯化鋰復(fù)合誘變。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致死率可達(dá)到96.3%，正突變率也達(dá)到了37.1%，比單一誘變效果要好。

2.4 高產(chǎn)菌的篩選

誘變后的單菌落在篩選平板上培養(yǎng)后形成淀粉圈，挑取10個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，研究HC 值與酶活的關(guān)系，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，HC 值的大小在一定程度上反映了菌株產(chǎn)α－淀粉酶的能力，HC值越大，產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

以枯草芽孢桿菌BL01 為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)多次復(fù)合誘變，初篩出HC 值較大的100 株突變株，再經(jīng)復(fù)篩、發(fā)酵后測(cè)定酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有58株突變菌的酶活比原始菌株提高，將其中一株酶活高且產(chǎn)酶穩(wěn)定的菌株命名為BL01－13。該高產(chǎn)菌株誘變后酶活達(dá)到357.70U·mL－1，是出發(fā)菌株的2.02倍。

表1 HC值與酶活的關(guān)系Tab .1 The relationship between HC value and enzyme activity

2.5 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性（表2）

表2 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性（n＝3）Tab.2 Genetic stability of high－producing strain（n＝3）

由表2可知，高產(chǎn)菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，傳代5代后，酶活穩(wěn)定在（357.73±4.06）U·mL－1范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

采用紫外－氯化鋰對(duì)產(chǎn)α－淀粉酶菌株枯草芽孢桿菌BL01進(jìn)行復(fù)合誘變，在紫外照射時(shí)間為150s、氯化鋰濃度為0.3%的最佳誘變條件下，經(jīng)過(guò)淀粉圈初篩、發(fā)酵復(fù)篩，得到一株高產(chǎn)菌BL01－13，酶活達(dá)到357.70U·mL－1，是出發(fā)菌株的2.02倍，該菌遺傳穩(wěn)定性良好，為淀粉酶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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