復(fù)方中藥對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠海馬NF-κB p65、TNF-α和IL-10表達(dá)的影響

劉顯斌1，吳春燕2

(1. 山東省水上運(yùn)動(dòng)管理中心，山東 日照276800；2. 山東省體育科學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南250012)

摘要：目的研究復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方對(duì)長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)大鼠海馬炎性因子NF-κB、TNF-α和IL-10的影響，進(jìn)一步探討該中藥的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。方法45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和中藥組，每組15只。其中，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和中藥組進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練，時(shí)間為7周。用Western-blotting法測(cè)定海馬NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平，用ELISA法觀察大鼠海馬TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；中藥組NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯低于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表達(dá)水平則明顯高于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(P<0.01)。結(jié)論：復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方可能通過(guò)降低NF-κB p65、TNF-α表達(dá)水平抑制長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的炎癥反應(yīng)，并通過(guò)升高IL-10表達(dá)水平促進(jìn)抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；海馬；NF-κB p65，TNF-α，IL-10

中圖分類號(hào)：G804.7

收稿日期：2015-03-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家體育總局重點(diǎn)研究領(lǐng)域攻關(guān)課題(編號(hào)：2014B058)。

作者簡(jiǎn)介：劉顯斌(1971-)，男，高級(jí)教練員，研究方向運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與體能康復(fù)。

Effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in Rat Hippocampus with high intensity exercise

LIU Xian-bin1, WU Chun-yan2

(1.ShandongWaterSportsManagementCenter,Rizhao276800,Shandong,China; 2.ShandongResearchCenterofSportsScience,Jinan250102,Shandong,China)

Abstract:Objective: To study the effects of compound Chinese medicine on the expression of NF-κB p65, TNF-α and IL-10 in rat hippocampus with long-term high intensity exercise.Methods: Male SD rats were randomly divided into three groups: control group (n=15), high intensity exercise group (n=15) and Chinese medicine group (n=15). The exercise project was applied by 7 weeks treadmill at progressive increase exercise intensity．The level of protein expression of NF-κB p65 in rat hippocampus was detected by the methods of Western blotting. The levels of protein expression of TNF-α, IL-10 were determined by the methods of ELISA.Results: Compared with the control group, the levels of protein expression of NF-κB p65, TNF-α, IL-10 in high intensity exercise group were obviously increased. The levels of protein expression of NF-κB p65 and TNF-α in Chinese medicine group were significantly decreased compared with those in high intensity exercise group. The levels of protein expression of IL-10 in Chinese medicine group were obviously increased compared with those in high intensity exercise group.Conclusions:The compound Chinese medicine can inhibit inflammatory by reducing the expression of NF-κB p65 and TNF-α, and promote anti-inflammatory by increasing the expression of IL-10, so as to protect the brain from ischemia injury probably.

Key words:high intensity exercise; Hippocampus; NF-κB p65；TNF-α；IL-10

已有研究證實(shí)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起機(jī)體多種炎性因子水平的變化，因而引發(fā)一系列炎性反應(yīng)[1-2]。NF-κB是近年發(fā)現(xiàn)的一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在腦缺血性損傷后腦組織的炎癥反應(yīng)中扮演重要角色[3]。腦組織缺血時(shí)，NF-κB被特異性激活，通過(guò)調(diào)控腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6 (IL-6)、白介素-1( IL-1)、、白介素-10 (IL-10)等多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)，參與缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程。長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可使機(jī)體腦部血流量下降，氧供相對(duì)不足，大量炎性細(xì)胞聚集，引發(fā)大量炎性介質(zhì)和炎性細(xì)胞因子的釋放，出現(xiàn)缺血、缺氧性損傷，從而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能下降。

傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)疲勞的消除方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。前期研究已經(jīng)證實(shí)[4]，復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方可以通過(guò)抗氧自由基，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平，提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子水平等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究以炎癥反應(yīng)為切入點(diǎn)，通過(guò)建立大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型，觀察長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下大鼠海馬炎性因子NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)水平的變化，并用復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方進(jìn)行干預(yù)，從炎癥反應(yīng)層面進(jìn)一步探討其對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組

雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠45只，7周齡，清潔級(jí)，體重187.6±15.3g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和中藥組，每組15只。

1.2運(yùn)動(dòng)模型的建立

對(duì)照組不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組和中藥組在小動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。采用的運(yùn)動(dòng)方案參考 Bedford[5]和 Wisloff[6]的遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(并略加修改)，時(shí)間為7周(具體方案見(jiàn)表1)。力竭標(biāo)準(zhǔn)為：大鼠不能保持預(yù)定速度，3次以上滯留于跑道后1/3處，刺激驅(qū)趕無(wú)效。行為特點(diǎn)表現(xiàn)為神精倦怠、呼吸深大，俯臥位，對(duì)刺激反應(yīng)不明顯。

表1　動(dòng)物訓(xùn)練方案(m/min×min)

1.3藥物制備及給藥方法

中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方組成：白術(shù)、熟地、人參、川芎、茯苓、甘草、白芍、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、杜仲各9g、川斷、山藥、牛膝各6g、肉桂3g(由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供) ，將以上藥用蒸餾水浸泡30 min，煎煮兩次(30 min/次) ，過(guò)濾，合并濾液加熱蒸發(fā)濃縮，制成100%濃度，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中藥組每天給予益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方水煎劑0.1ml/10mg，于運(yùn)動(dòng)前半小時(shí)灌胃，對(duì)照組及大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃7周。

1.4取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24小時(shí)，將各組大鼠深度麻醉后快速斷頭，分離海馬，先置于液氮罐中速凍，后-70℃超低溫冰箱保存。

1.5儀器與試劑

1.5.1儀器

離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf-5430)，低溫冰箱(日本三洋MDF-382E型)，移液器(德國(guó)EPPENDORF)，恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型)，電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，制冰機(jī)(德國(guó)AF10 SCOTSMAN)，電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.5.2試劑

NF-κB抗體(美國(guó)CST公司)，TNF-α、IL-10ELISA試劑盒，DAB顯色試劑盒。

1.6指標(biāo)測(cè)試

1.6.1Western-blotting法檢測(cè)海馬NF-κB p65蛋白表達(dá)

從-70℃超低溫冰箱中每組取出5個(gè)海馬組織，加入適量裂解液后置于冰上進(jìn)行勻漿； 12000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量并調(diào)平各組蛋白濃度；分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?；各樣本等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，室溫下振搖1小時(shí)，以封閉膜上的非特異結(jié)合；封閉后的膜加入稀釋的一抗工作液中，4℃ 反應(yīng)過(guò)夜；TBST洗膜，10分鐘×3次；洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液中，室溫、避光振搖60分鐘；將膜取出，TBST洗滌，10分鐘×3次；顯色，曝光，Image J軟件計(jì)算條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白和β-actin的Optical Density (OD)比值。

1.6.2ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-10的蛋白表達(dá)

將每組剩余的10個(gè)海馬組織勻漿離心后取上清液，采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-10的水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以x±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05 為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

2結(jié)果

2.1各組大鼠海馬NF-κB p65的蛋白表達(dá)

對(duì)照組可見(jiàn)少量NF-κB p65表達(dá)，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)NF-κB p65蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，中藥組NF-κB p65蛋白表達(dá)量則明顯低于大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組(P<0.01)(見(jiàn)圖1，2)。

A為對(duì)照組，B為大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組，C為中藥組 圖1　各組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達(dá)變化 注：△△表示，與對(duì)照組相比，P<0.01；##表示，與大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，P<0.01。

圖2　各組大鼠海馬NF-κB p65蛋白表達(dá)特點(diǎn)

2.2各組大鼠海馬TNF-α、IL-10的蛋白表達(dá)

組別TNF-α(ng/L)IL-10(ng/L)對(duì)照組大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組中藥組127.86±18.54185.41±21.33△△166.97±19.64#141.23±20.66225.71±30.69△△261.62±27.53##

注：△△表示，與對(duì)照組相比，P<0.01；#表示，與大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，P<0.05，##表示，與大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組相比，P<0.01。

3討論

長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)作為一種對(duì)機(jī)體的過(guò)度應(yīng)激，超出了機(jī)體生理機(jī)能所能承受的負(fù)荷，可對(duì)機(jī)體造成一定的損傷[7]。大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的腦缺血缺氧性損傷可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)與障礙，是引發(fā)運(yùn)動(dòng)疲勞的可能機(jī)制之一。在眾多的腦缺血缺氧性損傷的病理機(jī)制中，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)激活的炎癥反應(yīng)可加重機(jī)體組織的損傷，促進(jìn)繼發(fā)性腦損害發(fā)生，成為腦缺血再灌注損傷的重要組成部分和主要過(guò)程之一。

NF-κB是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的激活是腦缺血性損傷后腦組織的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。NF-κB存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，是NF-κB/Rel蛋白家族成員，由多肽p50和p65亞基形成p50-p65同源二聚體及p50-p65異源二聚體。其中發(fā)揮主要生理功能的是p50-p65異源二聚體。NF-κB未激活時(shí)與抑制蛋白IκB結(jié)合位于胞質(zhì)，在某些刺激因素作用下IκB降解，并與 NF-κB解離后被激活，進(jìn)入胞核與特定基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。多種炎癥遞質(zhì)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中包含κB位點(diǎn)，如TNF-α、IL-1、IL-6等，這些因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重腦損傷，在缺血再灌注后所引發(fā)的繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用。

TNF-α是被激活的巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，在腦缺血后幾分鐘激活，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生TNF- α、IL-1等炎癥反應(yīng)因子。增多的TNF-α、 IL-1可進(jìn)一步活化小膠質(zhì)細(xì)胞[8]，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，包括轉(zhuǎn)錄因子核因子NF-κB、TNF、IL 等。TNF-α 與受體 TNFRl (p55)和 TNFR2 (p75)結(jié)合后激活蛋白激酶、磷脂酶A2等胞內(nèi)信使分子，也可活化細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞因子、COX-2及iNOS等的表達(dá)。TNF-α不僅能自身激活，而且還能促進(jìn)其他多種促炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，并引起細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征等。

IL-10由Th2細(xì)胞、某些Thl細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞等產(chǎn)生，是重要的抗炎細(xì)胞因子。IL-10作為一種免疫抑制因子，能夠抑制活化單核細(xì)胞的促炎因子IL-lα、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、集落刺激因子的產(chǎn)生、表達(dá)。并可以通過(guò)阻斷核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB下調(diào)IL-1β、IL-6 等炎癥因子對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖的剌激作用，下調(diào)細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)和活性，從而抑制TNF-α和NO，抑制白細(xì)胞的聚集，從而起到抗炎作用[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)建立了長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型，并觀察大鼠海馬組織中炎性因子NF-κBp65 、TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)疲勞的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組大鼠NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的腦缺血缺氧可同時(shí)激活促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)。

我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)藥注重辯證施治，在抗運(yùn)動(dòng)疲勞方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)。長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的運(yùn)動(dòng)疲勞屬于中醫(yī)“勞倦”、“虛勞”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精，主骨、生髓，為先天之本，腦為髓海。勞則傷腎，因此長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可致腎精不足，髓?？仗?。氣血是人體最基本的生命物質(zhì)，腦離不開(kāi)氣血的溫煦、儒養(yǎng)。勞則耗傷氣血等精微物質(zhì)，腎精不足不能化生氣血，都可導(dǎo)致氣血虧虛，腦失濡養(yǎng)，引起缺血性腦損傷等病理生理過(guò)程。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后引起的腎精不足，氣血虧虛是運(yùn)動(dòng)疲勞的主要病因病機(jī)。為此，本研究選用復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方進(jìn)行干預(yù)，旨在探討該方對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制，從而為該方藥延緩或消除運(yùn)動(dòng)疲勞提供分子水平的理論依據(jù)。益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方由八珍湯和肉桂、牛膝、川斷、補(bǔ)骨脂、杜仲、山藥共14味中藥組成，共奏補(bǔ)腎益精、氣血雙補(bǔ)之效。

本研究結(jié)果表明，中藥組的NF-κB p65、TNF-α蛋白表達(dá)水平較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組均顯著降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10蛋白表達(dá)水平較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組顯著升高(P<0.01)。因此說(shuō)明，復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方可能通過(guò)降低NF-κB p65、TNF-α表達(dá)水平抑制長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的炎癥反應(yīng)，并通過(guò)升高IL-10表達(dá)水平促進(jìn)抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮對(duì)腦組織及神經(jīng)功能的保護(hù)作用。

綜上所述，長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的腦缺血缺氧可能引起NF-κB p65、TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)增加，同時(shí)激活促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)。復(fù)方中藥益氣養(yǎng)血補(bǔ)腎方可能通過(guò)降低NF-κB p65、TNF-α表達(dá)水平抑制長(zhǎng)期大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引起的炎癥反應(yīng)，并通過(guò)升高IL-10表達(dá)水平促進(jìn)抗炎作用，減輕缺血缺氧性腦損傷，從而發(fā)揮對(duì)腦組織及神經(jīng)功能的保護(hù)作用。

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