陳曉銘 胡卓清 李濰 劉美蓮 吳美芬 方爍 武革

·論著·

CD40-1C/T多態(tài)性(rs1883832)與粵西漢族人Graves病的關(guān)系

陳曉銘 胡卓清 李濰 劉美蓮 吳美芬 方爍 武革

目的探討CD40基因單核苷酸多態(tài)性(rs1883832)與粵西漢族人群Graves病的關(guān)系。方法選取Graves病患者219例(Graves病組)和健康體檢人員200例(對照組)。收集相關(guān)資料，檢測甲狀腺激素(游離T3、游離T4)、促甲狀腺激素(TSH)及促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)水平。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)對樣本基因分型。分析基因多態(tài)性與Graves病遺傳易感性、家族史、眼病和預(yù)后的關(guān)系，及TRAb水平在不同基因型攜帶者之間的差異。結(jié)果(1)Graves病組等位基因C分布頻率高于對照組(56.8%vs.47.3%，χ2=7.722,P=0.005)；共性及隱性遺傳模型均顯示Graves病組CC基因型高于對照組(38.4%vs.25.5%，χ2=8.054,P共性=0.018;χ2=7.912,P隱性=0.005)；相對于等位基因T攜帶者，CC基因型增加Graves病發(fā)病風(fēng)險[CCvs. TT：優(yōu)勢比(OR)=1.89，CCvs.CT：OR=1.77，CCvs.CT+TT：OR=1.83)。(2)等位基因與基因型分布頻率在有/無家族史、伴/不伴眼病及初發(fā)/復(fù)發(fā)亞組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。(3)在Graves病組中，C等位基因攜帶者TRAb水平較TT基因型者高[(18.23±0.96)vs.(12.65±1.68)IU/L，F(xiàn)=4.576，P=0.002]。結(jié)論CD40-1C/T多態(tài)性(rs1883832)可能與粵西漢族人群 Graves病及TRAb水平相關(guān)，與甲狀腺眼病、家族史及預(yù)后無關(guān)。

Graves?。籆D40；基因多態(tài)性

Graves 病是器官特異性自身免疫性疾病，其確切病因仍不清楚,但遺傳學(xué)研究認(rèn)為遺傳背景由多個外顯率不同的基因所決定，并存在基因-基因、基因-環(huán)境交互作用[1-2]。CD40參與淋巴細(xì)胞的增殖與分化，在適應(yīng)性和固有性免疫過程中發(fā)揮重要作用。CD40的異常表達(dá)與Graves病等多種自身免疫性疾病有關(guān)，CD40基因Kozak序列的基因多態(tài)性可導(dǎo)致CD40表達(dá)、結(jié)構(gòu)和(或)功能缺陷[3-4]。候選基因法、全基因組關(guān)聯(lián)分析及家系連鎖分析均認(rèn)為位于20q11.2-20q13區(qū)域的CD40-1C/T多態(tài)性(rs1883832)是Graves病的遺傳易感性風(fēng)險位點之一[5-7]。基因多態(tài)性具有種族差異性已是不可爭議的事實，然而在中國人群開展的候選基因法研究結(jié)論也存在較大的不一致性。本研究將針對粵西漢族人群中CD40-1C/T多態(tài)性(rs1883832)與Graves病遺傳易感性的關(guān)系作進(jìn)一步探討。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 根據(jù)內(nèi)科學(xué)Graves病的診斷，排除Graves病以外伴和(或)曾患其他免疫性疾病者[8]。收集2013年5月—2013年12月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門診或住院Graves病患者219例(男58例，女161例)，作為Graves病組，平均年齡(43.22±1.54)歲。按有/無Graves病家族史(81例/138例)，伴/不伴眼病(72例/147例)，初發(fā)組/復(fù)發(fā)組(58例/81例)為特征分亞組，分析亞組特征與基因多態(tài)性的關(guān)系。對照組選取同期體檢中心健康者200例(男52例，女148例)，平均年齡(43.10±1.36)歲，排除有免疫性疾病史和(或)有家族史者。以上所有入選者均獲知情同意，無任何血緣關(guān)系，均為漢族，祖籍粵西地區(qū)。

1.2 主要試劑與儀器 DNA提取用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，寶生物公司提供引物合成及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性長度多態(tài)性(PCR-RFLP)試劑，測序由上海生工完成。甲狀腺相關(guān)激素及TRAb的檢測儀器為羅氏Cobase411，正常人各指標(biāo)參考值范圍為游離T3：2.6～6.8 pmol/L；游離T4:10.14～23.8 pmol/L;促甲狀腺激素(TSH):0.34～4.0 mU/L(成人)，0.34～6.0 mU/L(非成人)；TSH受體抗體(TRAb):0～1.75 IU/L。

1.3 方法

1.3.1 體檢及生化檢查 對受試者進(jìn)行基本資料的采集：包括年齡、性別、家族史、是否復(fù)發(fā)、治療情況、甲狀腺腫大情況及等級、是否突眼及等級等?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測甲狀腺激素(游離T3、游離T4)及TSH，酶聯(lián)免疫吸附法測定TRAb滴度，所有檢查均在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科進(jìn)行。

1.3.2 DNA的提取 取受試者的外周抗凝靜脈血700 μl，用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA100 μl(5.5 ng/μl)，于-80°C保存。

1.3.3 PCR擴增目的片段 PCR引物參照文獻(xiàn)的設(shè)計，上游引物：5′TGGGAATGTTCTGGGGAA3′，下游引物：5′AGGCCTCTTCCCCGAA3′。PCR產(chǎn)物320 bp，反應(yīng)體系為25 μl：ExTaq 0.125 μl, 10×Ex Taq Buffer 2.5 μl, MgCl22 μl, dNTP mixture 2 μl, 上、下游引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，剩余高壓滅菌水補足。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3 min,94°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，共30個循環(huán)，終未72°C延伸10 min。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物與1 μl 10×Loading buffer混合，在2%的瓊脂糖膠電泳(100 V，30 min)，觀察結(jié)果并拍照，只出現(xiàn)一條目的條帶的進(jìn)入下一步酶切實驗。

1.3.4 基因分型與驗證 取產(chǎn)物10 μl，NCOI 1 μl, buffer 2 μl, BSA 2 μl，高壓滅菌水補足至20 μl體系，在37°C水浴箱反應(yīng)5 ～7 h。反應(yīng)后取酶切產(chǎn)物5 μl與1 μl 10×Loading buffer混合，2%的瓊脂糖膠電泳(100 V，30 min)。直接在紫外儀下判斷基因型并拍照。結(jié)果判讀者為其他試驗員進(jìn)行盲法判讀，試驗結(jié)束后隨機挑選3種基因型的部分不同樣本進(jìn)行測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 酶切結(jié)果 RFLP電泳圖中只出現(xiàn)一條320 bp條帶的為TT基因型，有136 bp、183 bp和320 bp 3條帶者為CT基因型，出現(xiàn)136 bp及183 bp兩條帶為CC基因型(圖1)，隨機挑選3種基因型的部分不同樣本進(jìn)行測序驗證，結(jié)果與RFLP相同(圖2～4)。

注:1:TT基因型;2,5,6,7:CC基因型;3,4:CT基因型;M:DL-500Marker;RFLP:限制性片段長度多態(tài)性圖1 CD40-1C/T多態(tài)性基因型RFLP電泳結(jié)果

2.2 對照組樣本基因型分布 經(jīng)檢驗對照組P=0.072，符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 Graves病及對照組CD40-1C/T多態(tài)性的分布

經(jīng)檢驗CC、CT和TT 3種基因型分布頻率之間在Graves病與對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.054,P=0.018)，等位基因C、T頻率分布亦有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.722,P=0.005)，見表1。分別采用基因遺傳的共性(CCvs. CTvs. TT)、隱性(CCvs. CT+TT)及顯性模型(CC+CTvs. TT)分析，顯示CCvs. TT、CCvs. CT及CCvs. CT+TT在兩組中均有統(tǒng)計學(xué)意義[CCvs. TT：OR=1.89,95%CI：1.14～3.13,P=0.013;CCvs. CT：OR=1.77,95%CI：1.12～2.81,P=0.015;CCvs. CT+TT：OR=1.83,95%CI：1.20～2.76,P=0.005]。

圖2 CD40-1C/T多態(tài)性CC基因型測序圖圖3 CD40-1C/T多態(tài)性TT基因型測序圖圖4 CD40-1C/T多態(tài)性CT基因型測序圖

表1 CD40-1C/T多態(tài)性基因型與等位基因頻率在Graves病組和對照組的分布比較

注：與CT+TT基因型比較,χ2=7.912,aP=0.005;與CC+CT基因型比較，χ2=2.10，bP=0.147

2.4 CD40-1C/T多態(tài)性在Graves病 3個亞組的分布 等位基因C/T與基因型分布頻率在有/無家族史、伴/不伴眼病、初發(fā)組/復(fù)發(fā)組3個亞組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

2.5 CD40-1C/T多態(tài)性與初發(fā)組、復(fù)發(fā)組及初發(fā)組+復(fù)發(fā)組TRAb水平的關(guān)系 經(jīng)校正年齡與性別后在Graves病組的初發(fā)組、復(fù)發(fā)組及初發(fā)+復(fù)發(fā)組中，除復(fù)發(fā)組CC、CT及TT基因型之間TRAb水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。C等位基因攜帶者(CC+CT)的TRAb水平較TT基因型者高(P均≤0.01)，見表3。

3 討論

CD40/CD40配體屬于腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族成員的共信號分子，參與B細(xì)胞的活化及分化、調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答等免疫活動[4]。CD40廣泛表達(dá)于多種不同功能的細(xì)胞及組織：如B細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及甲狀腺細(xì)胞等，且研究發(fā)現(xiàn)CD40分子在Graves病患者甲狀腺組織中呈高表達(dá)[4-9]。位于20q11.2-20q13區(qū)域的CD40基因Kozak序列是CD40分子起始翻譯的必要核苷酸片段，CC基因型及等位基因C可以增加CD40 mRNA轉(zhuǎn)錄效率，使CD40分子表達(dá)增加15%～32%[3,10]。

本試驗在粵西漢族人群中檢測CD40基因多態(tài)性(rs1883832)與Graves病的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明等位基因及基因型分布頻率在Graves病組與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)：相對于等位基因T及其基因型，等位基因C及CC基因型個體Graves病的發(fā)病風(fēng)險增加；CD40-1C/T多態(tài)性可能與粵西漢族人群Graves病發(fā)病相關(guān)。Graves病是由多個外顯率不同的基因作用影響其發(fā)病易感性的復(fù)雜疾病，3種遺傳模型中共性模型更符合Graves病發(fā)病的遺傳易感機制，共性模型顯示等位基因C呈遞進(jìn)性增加Graves病的發(fā)病風(fēng)險(CCvs. TT:OR=1.89,CCvs. CT:OR=1.77，CTvs. TT:OR=1.07)。Yang等[5]認(rèn)為單核苷酸多態(tài)性 rs1883832與Graves病相關(guān)。Hsiao等[11]則認(rèn)為等位基因T及TT基因型與晚發(fā)Graves病有關(guān)。孫玲玲等[12]認(rèn)為該位點多態(tài)性只與女性患者相關(guān)。在相同種群及類似背景下的研究結(jié)果不一致的可能原因：(1)中國地域廣闊，影響Graves病發(fā)生及發(fā)展的環(huán)境因素如飲食等因素千差萬別。(2)中國人群中族系眾多，基因多態(tài)性在族系中也可能存在差異。(3)個別研究在樣本質(zhì)量控制或?qū)嶒炛锌赡艽嬖谡`差。

CD40基因多態(tài)性(rs1883832)與Graves病相關(guān)癥狀的相關(guān)性不甚明確，本研究未發(fā)現(xiàn)等位基因C/T及基因型分布頻率在有/無眼病、初發(fā)/復(fù)發(fā)及有/無家族史這些亞組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在粵西漢族人群中單核苷酸多態(tài)性 rs1883832可能與Graves病眼病、預(yù)后及家族史無關(guān)。而馬利丹等[13]研究則認(rèn)為rs1883832與Graves病停藥后復(fù)發(fā)有關(guān)或與眼病有關(guān)，但這些研究對照組樣本基因型分布經(jīng)檢驗不符合Hardy-Weinberg平衡，且其未解釋不平衡的原因。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)CD40基因的其他單核苷酸多態(tài)性 rs745307、rs11569309、rs3765457與Graves病預(yù)后有關(guān)，且發(fā)現(xiàn)這些單核苷酸多態(tài)性與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4基因多態(tài)性的交互作用是Graves病復(fù)發(fā)的一個獨立危險因素。提示Graves病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后可能并不共享基因某一單核苷酸多態(tài)性。

表2 CD40-1C/T多態(tài)性在Graves病亞組中分布比較[例數(shù)(%)]

表3 CD40-1C/T多態(tài)性與TRAb水平的關(guān)系

注：與TT基因型相比，aP<0.01；bP=0.01；TRAb：促甲狀腺激素受體抗體

CD40-1C/T多態(tài)性與Graves病相關(guān)性可能與調(diào)節(jié)TRAb有關(guān)，TRAb與TSH受體結(jié)合而刺激甲狀腺細(xì)胞功能。本研究在Graves病組中，分別對初發(fā)組、復(fù)發(fā)組及初發(fā)組+復(fù)發(fā)組3種基因型之間的TRAb水平進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在初發(fā)組及初發(fā)組+復(fù)發(fā)組中C等位基因攜帶者的TRAb水平均較TT基因型者高。而在顯性模型下(CC+CTvs.TT)CD40-1C/T多態(tài)性與Graves病發(fā)病無關(guān)，原因可能為TRAb水平作為連續(xù)性變量，受免疫狀態(tài)直接調(diào)節(jié)，單個等位基因突變即可影響TRAb的表達(dá)。但是由于亞組的例數(shù)較少，其關(guān)聯(lián)性還有待更多的試驗證實。C等位基因可能參與TRAb異常表達(dá)調(diào)節(jié)而致甲狀腺功能亢進(jìn)，其機制可能是：(1)CD40分子在B細(xì)胞表面的高表達(dá)使B細(xì)胞更易于被激活，甲狀腺特異性抗體(如TRAb)分泌增加。(2)甲狀腺靶組織高表達(dá)CD40分子使下游細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-6)分泌增加、T細(xì)胞免疫異常激活而致甲狀腺自身免疫[15]。

本研究初步證實了CD40-1C/T多態(tài)性與粵西漢族人Graves病及其TRAb水平相關(guān)，為進(jìn)一步研究CD40分子與Graves病發(fā)病之間的關(guān)系提供重要的理論基礎(chǔ)。但是本研究樣本數(shù)尚不充足，群體代表性不夠廣泛，實驗分型技術(shù)效率低，這些都是以后待改進(jìn)的地方。

[1] Brix TH, Kyvik KO, Christensen K, et al. Evidence for a major role of heredity in Graves′disease:a population-based study of two Danish twin cohorts[J]. J Clin Endocrinol Metab,2001,86(2):930-934.

[2] Balazs C.The role of hereditary and environment factors in autoimmune thyroid disease[J].Orv Hetil,2012,153(26):1013-1022.

[3] Jacobson EM, Huber AK, Akeno N, et al.A CD40 Kozak sequence polymorphism and susceptibility to antibody-mediated autoimmune conditions:the role of CD40 tissue-specific expression[J].Genes Immun,2007,8(3):205-214.

[4] 吳砂.免疫細(xì)胞膜分子//龔非力，主編.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2012:69-72.

[5] Yang J, Qin Q, Yan N, et al. CD40 C/T(-1) and CTLA-4 A/G(49) SNPs are associated with autoimmune thyroid diseases in the Chinese population[J]. Endocrine,2012,41(1):111-115.

[6] 王海寧，江鶴，劉威，等.在中國漢族人群中CD40 5′非翻譯區(qū)的SNP與Graves病相關(guān)∥中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編，西安，2013[C].2013:119.

[7] Tomer Y, Ban Y, Concepcion G, et al.Common and unique susceptibility loci in Graves′ and Hashimoto′s disease: results of whole-genome screening in a data set of 102 multiplex families[J]. Am J Hun Genet,2003,73(4):736-747.

[8] 滕衛(wèi)平，甲狀腺功能亢進(jìn)癥//葛均波，徐永健，主編.內(nèi)科學(xué)[M].第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:685-692.

[9] Smith TJ, Sciaky D, Phipps RP, et al. CD40 expression in human thyroid tissue: evidence for involvement of multiple cell types in autoimmune andneoplastic diseases[J].Thyoid,1999,9(8):749-755.

[10] Jacobson EM, Concepcion E, Oashi T, et al. A Graves′ disease-associated Kozak sequence single-nucleotide polymorphism enhance the efficiency of CD40 gene translation: a case for translational pathophysiology[J].Endocrinology,2005,146(6):2684-2691.

[11] Hsiao JY, Tien KJ, Hsiao CT, et al.A C/T polymorphism in CD40 gene is not associated with susceptibility and phenotype of Graves′ disease in Taiwanese[J].Endocr J,2008,55(3):477-484.

[12] 孫玲玲，褚訊，黃薇，等.CD40基因多態(tài)性與Graves病的相關(guān)性研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(5):655-657.

[13] 馬利丹，閻勝利，李鵬，等.CD40基因5′非翻譯區(qū)-1位點C/T多態(tài)性與Graves病藥物治療停藥后復(fù)發(fā)的相關(guān)性[J].免疫學(xué)雜志,2010,26(6):517-520,526.

[14] Wang PW,Chen IY,Juo SH,et al.Genotype and phenotype predictors of relapse of Graves′ disease after antithyroid drug withdrawal[J].Eur Thyroid J,2013,1(4):251-258.

[15] Huber AK,Finkelman FD,Li CW,et al. Genetically driven target tissue overexpression of CD40: a novel mechanism in autoimmune disease[J].J Immunol,2012,189(6):3043-3053.

RelationshipbetweenCD40-1C/Tpolymorphism(rs1883832)andGraves′diseaseofHanpopulationinwesternregionofGuangdongprovince

ChenXiaoming,HuZhuoqing,LiWei,LiuMeilian,WuMeifen,FangShuo,WuGe.

DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524001,ChinaCorrespondingauthor:WuGe,Email:wuge427@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the association between the single nucleotide polymorphism(SNP, rs1883832) of CD40 gene and Graves′disease(GD) of Han population in western Guangdong.MethodsA set of subjects including 219 patients with GD (GD group) and 200 healthy controls(control group) were recruited.Related informations were collected, and levels of thyroid hormones (free T3,free T4), thyroid stimulating hormone (TSH) and thyrotropin receptor antibodies(TRAb) were tested. SNPs were genotyped by the method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).The association between polymorphism and the susceptibility of GD,family history,ophthalmopathy and prognosis of GD were analyzed.Meanwhile, the levels of TRAb among different genotypes were compared.Results(1)Higher allele C frequency was observed in GD group than control group(56.8%vs.47.3%,χ2=7.722,P=0.005).Compared with control group,additive and recessive genetic models showed the frequency of CC genotype were higher in GD group (38.4%vs.25.5%,χ2=8.054,PAdditive=0.018;χ2=7.912,PRessive=0.005).Compared with patients carried allele T, GD risk of the individuals who carried CC genotype was significantly increased[CCvs.TT:odd ratio (OR)=1.89, CCvs.CT:OR=1.77,CCvs.CT+TT:OR=1.83].(2)There was no significant difference in allele or genotype frequency of CD40 SNP between patients with and without GD family history, with and without ophthalmopathy, GD onset and relapse subgroup(allP>0.05). (3)In GD group, the levels of TRAb were significant higher in those with CC or CT genotype than other genotype[(18.23±0.96)vs.(12.65±1.68)IU/L,F=4.576,P=0.002].ConclusionCD40-1C/T polymorphism(rs1883832) is associated with GD and TRAb level of Han population in western Guangdong. No correlation is found between CD40-1C/T polymorphism and ophthalmopathy, family history and prognosis of GD.

Graves′ disease;CD40;Gene polymorphisms

(IntJEndocrinolMetab，2015，35：11-15)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.01.003

廣東省社會發(fā)展領(lǐng)域科技計劃項目(2012B031800489)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金立項課題(A2013432)；湛江市非資助科技攻關(guān)計劃項目(2013B01030)

524001 湛江，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科

武革，Email:wuge427@aliyun.com

2014-07-14)