翟藝，梁小波

（昆明理工大學(xué)食品安全研究院，云南昆明 650500）

來(lái)自鹿糞便中1株芽孢桿菌的鑒定及抗真菌肽發(fā)酵條件研究

翟藝，梁小波

（昆明理工大學(xué)食品安全研究院，云南昆明 650500）

以來(lái)自鹿糞便中1株芽孢桿菌為試驗(yàn)菌株，在分子水平上通過(guò)16S rDNA同源性序列分析、比較、鑒定，并通過(guò)形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、生理生化實(shí)驗(yàn)，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌J-2。分析影響芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽的主要因素，通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出，芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽的最佳發(fā)酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養(yǎng)基，接入9%的液體菌種，在溫度為37℃條件下發(fā)酵24 h。

芽孢桿菌；鑒定；抗真菌肽；發(fā)酵

長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治病蟲(chóng)害的方法主要是通過(guò)施加或噴灑化學(xué)農(nóng)藥來(lái)進(jìn)行［1］。化學(xué)農(nóng)藥的濫用或不合理使用一方面對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生了高毒、高殘留等諸多問(wèn)題，嚴(yán)重污染了土壤、水體和大氣，甚至破壞了原有的生態(tài)平衡［2］；另一方面也不斷增強(qiáng)了一些病菌和害蟲(chóng)的抗藥性，使農(nóng)藥的使用量與使用頻度交替上升、惡性循環(huán)，農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中殘留量不斷增加，極大威脅了人類及牲畜的安全。2012年4月，英國(guó)牛津大學(xué)、倫敦帝國(guó)學(xué)院和美國(guó)一些大學(xué)的科學(xué)家在權(quán)威科學(xué)雜志《Nature》上報(bào)道，導(dǎo)致部分動(dòng)植物物種滅絕的主要原因是傳染病，其中70%是由真菌引起。受人類貿(mào)易活動(dòng)、旅行和氣候變化影響，真菌對(duì)人類食物供應(yīng)和生物多樣性的威脅增大。真菌引起的植物病害現(xiàn)已成為經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的主要障礙，利用有益微生物防治植物病害是有效途徑之一［3］。由枯草芽孢桿菌研發(fā)的殺菌劑具有較好的綜合優(yōu)勢(shì)，在安全性、兼容性等方面而更符合有害生物綜合治理（IPM）要求。2014年，我們從鹿糞便中分離到1株對(duì)多種植物病原菌均具有強(qiáng)烈抗性的菌株，通過(guò)形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化試驗(yàn)等初步確定該菌株為芽孢桿菌，在分子水平上通過(guò)16S rDNA同源性序列分析，比較該菌與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及其它相近菌種的同源性，根據(jù)不同菌種之間部分特異性基因序列的差異進(jìn)行了鑒定，以期為利用其研制環(huán)保、節(jié)能、高效的生物農(nóng)藥和相關(guān)產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試芽孢桿菌由實(shí)驗(yàn)室自行分離篩選。病原指示菌為白色念珠菌，鑒定菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis AS 1.1159）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus.amyloliquefaciens AS 1.1131）均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB液體培養(yǎng)基向450 mL雙蒸水中加入酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、氯化鈉5.0 g，加熱至溶解，冷卻后經(jīng)2%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0，用雙蒸水補(bǔ)至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2 LB固體培養(yǎng)基向450 mL雙蒸水中加入酵母粉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂5.0 g，加熱至溶解，冷卻后經(jīng)2%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0，用雙蒸水補(bǔ)至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 基礎(chǔ)性培養(yǎng)基向450 mL雙蒸水中加入磷酸氫二鉀0.25 g、硫酸鎂0.10 g、胰蛋白胨5.00 g，待其溶解后，經(jīng)2%氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，補(bǔ)水至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.4 PSL培養(yǎng)基（馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入蔗糖20 g，自然pH，補(bǔ)水至1 000 mL，115℃高壓滅菌20 min。

1.2.5 PDP培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖胰蛋白胨液體培養(yǎng)基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20 g、胰蛋白胨5 g，自然pH，補(bǔ)水至1 000 mL，115℃高壓滅菌20 min。

1.2.6 PDL（200）培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基）將200 g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20 g，自然pH，補(bǔ)水至1000mL，115℃高壓滅菌20min。

1.2.7 PDL（500）培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基）

將500g馬鈴薯去皮，切塊后煮沸30 min，用4層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20 g，自然pH，補(bǔ)水至1000mL，115℃高壓滅菌20min。

1.2.8 NB培養(yǎng)基（營(yíng)養(yǎng)肉湯）向450 mL雙蒸水中加入牛肉膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、胰蛋白胨5.0 g，待其溶解后經(jīng)2%氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，補(bǔ)水至1 000 mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)觀察與染色利用光學(xué)顯微鏡測(cè)量菌體直徑、觀察形態(tài)；參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色［4］。

1.3.216 S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定采用Emblye法，對(duì)該芽孢桿菌進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)CTAB法提取芽孢桿菌DNA并將其作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板［5］。電泳反應(yīng)30 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并對(duì)PCR產(chǎn)物純化。然后與pUCm-T載體連接，16℃保溫桶內(nèi)連接過(guò)夜。將5 μL連接產(chǎn)物與100 μL感受態(tài)細(xì)胞在溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下反應(yīng)1 h，取出后涂布于含1%Amp的LB固體培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒并委托測(cè)序。將所得1444bp序列放入NCBI中進(jìn)行同源性分析，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 形態(tài)比較及特異性基因序列分析在同一培養(yǎng)皿上分別對(duì)實(shí)驗(yàn)菌、枯草芽孢桿菌（Bacillus. subtilis As 1.1159）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus.amyloliquefaciens AS 1.1131）進(jìn)行劃線培養(yǎng)，在溫度37℃下培養(yǎng)24 h后，觀察形態(tài)。根據(jù)不同芽孢桿菌基因序列位置不同鑒定。采用CTAB法提取上述3種菌的染色體DNA，并將其作為PCR反應(yīng)的模板DNA，電泳反應(yīng)30 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.3.4 芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液的獲得在LB固體培養(yǎng)基中挑取芽孢桿菌J-2單菌落，接種至100 mLLB液體培養(yǎng)基中（250 mL錐形瓶），在溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min下發(fā)酵24 h，獲得菌株J-2的發(fā)酵液。

1.3.5 碳源種類的影響將碳源1%的葡萄糖、1%的淀粉加入基礎(chǔ)性培養(yǎng)基中，再接種含量7%的芽孢桿菌J-2種子發(fā)酵液，在溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min下發(fā)酵24 h，并在溫度4℃、轉(zhuǎn)速13 000 r/min條件下離心1 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm孔徑的無(wú)菌水系濾膜過(guò)濾，得到芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，以基礎(chǔ)性培養(yǎng)基為對(duì)照，采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)量其產(chǎn)生的抑菌圈直徑［7］。

1.3.6 氮源種類的影響將氮源1%的葡萄糖+1%的硫酸銨、1%的可溶性淀粉+1%的硫酸銨、1%的葡萄糖+1%的氯化銨、1%的可溶性淀粉+1%的氯化銨分別替換基礎(chǔ)性培養(yǎng)基中的胰蛋白胨，再接種含量7%的芽孢桿菌J-2種子發(fā)酵液，按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，以碳源培養(yǎng)基為對(duì)照，采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)量芽孢桿菌J-2產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

1.3.7 培養(yǎng)基種類的影響將芽孢桿菌J-2種子發(fā)酵液按接種量7%接種至150 mL含大量碳源的培養(yǎng)基PDL（500）、PDL（200）、PDP、PSL和含大量氮源的培養(yǎng)基LB、NB中（250 mL錐形瓶），按1.3.5方法得J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源培養(yǎng)基、氮源培養(yǎng)基為對(duì)照，用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)量其產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

1.3.8 培養(yǎng)液初始pH的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mLPDL（200）培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，初始pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，將芽孢桿菌J-2種子發(fā)酵液按接種量7%接種至150 mLPDL（200）培養(yǎng)基中（250 mL錐形瓶），按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，取無(wú)菌發(fā)酵上清液調(diào)pH至7.0，用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量其芽孢桿菌J-2產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

1.3.9 發(fā)酵溫度的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mL PDL（200）培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度分別取23、30、37、44、51℃。按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，測(cè)量其產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

1.3.10 發(fā)酵時(shí)間的影響將芽孢桿菌J-2接種至100 mL PDL（200）培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，將芽孢桿菌種子發(fā)酵液按7%接種量接種至150 mL PDL（200）培養(yǎng)基中（250 mL錐形瓶），在溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下分別發(fā)酵18、24、30、36、42、48、54 h，按1.3.5方法得到芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，以基礎(chǔ)性培養(yǎng)基為對(duì)照，采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)量其產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

1.3.11 發(fā)酵條件正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)合各單因素實(shí)驗(yàn)，選擇PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP為培養(yǎng)基的4個(gè)水平，培養(yǎng)基初始pH水平為6.0、7.0、8.0、9.0時(shí)，選擇時(shí)間為18、24、30、36 h，裝液量定為50、100、150、200 mL（500 mL錐形瓶），接種量水平為3%、5%、7%、9%。對(duì)5因素的4個(gè)水平分別取值（表1），利用正交表L1645（5因素4水平）實(shí)驗(yàn)，溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)芽孢桿菌J-2。收集各發(fā)酵條件下的芽孢桿菌J-2無(wú)菌發(fā)酵上清液，以白色念珠菌為指示菌，用瓊脂打孔擴(kuò)散法分別測(cè)量它們產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小，通過(guò)方差分析得到芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽的較優(yōu)條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌J-2的分類鑒定

2.1.1 個(gè)體形態(tài)特征及菌落特征如圖1所示，菌株J-2在LB培養(yǎng)基上顯示為不透明白色、表面粗糙、邊緣不規(guī)則、不產(chǎn)生色素、短桿狀，兼性厭氧，具有運(yùn)動(dòng)性。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，色均勻，可形成內(nèi)生芽孢，游離芽孢囊橢圓形膨大，表面不易著色。

圖1 菌株J-2染色形態(tài)

2.1.216 S rDNA同源性的鑒定菌株J-2染色體DNA用PCR擴(kuò)增出單一條帶，PCR產(chǎn)物回收純化后，經(jīng)DNA測(cè)序，序列長(zhǎng)度為1444 bp。與多種芽孢桿菌同源性的比較數(shù)據(jù)（表2）表明，菌株J-2與枯草芽孢桿菌的同源性高達(dá)99.62%，與解淀粉芽孢桿菌同源性達(dá)到99.23%，初步推斷該菌為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。通過(guò)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）可以看出，菌株J-2與B.subtilis位于同一分支、同一種屬，與枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌的同源性均達(dá)到99%以上。

表2 J-2與其他相近芽孢桿菌的同源性

圖2 以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的J-2菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.1.3 與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌形態(tài)比較將菌株J-2、枯草芽孢桿菌（B.Subtilis AS 1.1159）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens AS 1.1131）在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，可以看出，菌株J-2生長(zhǎng)更旺盛，繁殖速度較快，菌株J-2與枯草芽孢桿菌表面較為粗糙，解淀粉芽孢桿菌表面相對(duì)光滑（圖3），菌株J-2的形態(tài)與枯草芽孢桿菌更加相近。

圖3 J-2菌與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌形態(tài)比較

2.1.4 特異性基因序列的分析從圖4可以看出，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的部分基因順序明顯不同。在枯草芽孢桿菌中，基因yyaR位于tetB-tetL的下游2003 bp處，而基因yyaO位于tetB（L）的上游并與之相鄰。在解淀粉芽孢桿菌中，yyaR位于tetB-tetL的上游并且與之相鄰。據(jù)此設(shè)計(jì)兩對(duì)引物YyaO-F/TetB-R與YyaR-F/TetB-R用于PCR擴(kuò)增，其中正向引物YyaO-F和YyaR-F分別來(lái)自yyaO和yyaR兩個(gè)基因的3'末端，反向引物TetB-R來(lái)自基因tetB的5'末端。OlegN.Reva等已經(jīng)成功地利用這兩對(duì)引物對(duì)多個(gè)可能為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的菌種進(jìn)行鑒定［6］。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像后的結(jié)果如圖5所示，當(dāng)以YyaO-F/TetBR作為引物時(shí)，解淀粉芽孢桿菌能夠擴(kuò)增，而該菌和枯草芽孢桿菌不能擴(kuò)增，可見(jiàn)該菌與解淀粉芽孢桿菌在這一基因區(qū)域內(nèi)，基因序列可能存在明顯的差異；以YyaR-F/TetB-R作為引物時(shí)，解淀粉芽孢桿菌不能被擴(kuò)增而該菌和枯草芽孢桿菌均能擴(kuò)增。表明該菌和枯草芽孢桿菌的這一特異性的基因序列相似。綜合分析，確定該菌為枯草芽孢桿菌。

圖4 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌部分序列的差異

圖5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 各條件對(duì)芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽的影響

2.2.1 碳源種類將芽孢桿菌J-2在不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別記錄12、24 h時(shí)芽孢桿菌J-2的生長(zhǎng)狀況。從表3可以看出，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，J-2發(fā)酵液較黏，抑菌圈直徑明顯增大?？梢?jiàn)增加碳源有利于芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽，但碳源的種類對(duì)抗真菌肽的產(chǎn)生沒(méi)有明顯影響。在產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)方面，碳氮比減小利于抗真菌物質(zhì)產(chǎn)生，碳氮比增大更易產(chǎn)生抗真菌肽，原因是芽孢桿菌J-2在代謝過(guò)程中糖類的合成利于該抗真菌肽產(chǎn)生。

表3 碳源種類的影響

2.2.2 氮源種類從表4可以看出，氮源幾乎不影響抗真菌肽的產(chǎn)生，芽孢桿菌J-2可以利用無(wú)機(jī)氮源或有機(jī)氮源，有利于擴(kuò)大生產(chǎn)抗真菌肽。

表4 氮源種類的影響

2.2.3 培養(yǎng)基種類從圖6可以看出，培養(yǎng)基種類對(duì)芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑有一定的影響。LB、NB和基礎(chǔ)培養(yǎng)基氮源豐富，菌株生長(zhǎng)良好，稀發(fā)酵液利于分離發(fā)酵產(chǎn)物，但明顯小于碳源培養(yǎng)基豐富條件下的芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液產(chǎn)生的抑菌圈直徑。芽孢桿菌J-2在碳源物質(zhì)的PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況優(yōu)于在氮源豐富的培養(yǎng)基，且抑菌圈直徑要明顯大，所以用含豐富碳源的培養(yǎng)基利于其產(chǎn)生抗真菌肽。合成培養(yǎng)基和碳源天然培養(yǎng)基對(duì)芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑的影響（表5）表明，芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈在天然碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)直徑更大，抗真菌活性更強(qiáng)，利于抗真菌肽的產(chǎn)生，且成本低。綜上所述，正交實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基因素的4個(gè)水平宜采用含有豐富碳源的天然培養(yǎng)基PDL（200）、PDL（500）、PSL和PDP。

圖6 培養(yǎng)基種類對(duì)抑菌圈直徑的影響

表5 合成培養(yǎng)基與天然培養(yǎng)基對(duì)抑菌圈直徑影響

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH圖7表明，培養(yǎng)基初始pH對(duì)芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑有一定的影響。pH為7.0時(shí)，芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑、抗真菌活性均達(dá)到最大，此條件有利于抗真菌肽的產(chǎn)生。pH為6.0、8.0、9.0時(shí)，芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑、抗真菌活性無(wú)明顯的變化。pH為5.0時(shí)，抑菌圈直徑明顯減小，抗真菌活性明顯減弱，不利于抗真菌肽的產(chǎn)生。說(shuō)明培養(yǎng)基初始最佳pH為6.0、7.0、8.0、9.0。

圖7 培養(yǎng)基初始pH對(duì)抑菌圈直徑的影響

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌圈直徑影響

2.2.5 發(fā)酵溫度通過(guò)圖8可以看出，發(fā)酵溫度對(duì)芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液抑菌圈直徑的影響不大，溫度可以影響酶反應(yīng)速率，但當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，抑菌圈直徑及其抗真菌活性將明顯下降，故37℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.6 發(fā)酵時(shí)間從圖9可以看出，芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液產(chǎn)生的抑菌圈直徑在18～30 h時(shí)逐漸增大，而后隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸減小。說(shuō)明正交實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間因素的4水平以18、24、30、36 h為宜。

圖9 發(fā)酵時(shí)間抑菌圈直徑影響

2.2.7 芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽發(fā)酵條件優(yōu)化5因素對(duì)芽孢桿菌J-2產(chǎn)抗真菌肽的綜合影響及極差分析如表6、表7所示。影響結(jié)果由大道小順序?yàn)榕囵B(yǎng)基、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)基初始pH。以芽孢桿菌J-2發(fā)酵上清液產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小作為衡量指標(biāo)，經(jīng)極差分析，得到關(guān)系圖（圖10），表明培養(yǎng)基為PDL（200）、pH7.0、發(fā)酵時(shí)間24 h、接種量9%、裝液量為150 mL時(shí)，所得抑菌圈直徑的和較其它水平下大，溫度為30～40℃時(shí)影響最小。因此抗真菌肽的較佳發(fā)酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養(yǎng)基，接入9%的液體菌種，在37℃條件下發(fā)酵24 h。

表6 因素對(duì)芽孢桿菌J-2產(chǎn)生抗真菌肽的綜合影響

表7 極差分析結(jié)果①

圖10 發(fā)酵上清液抑菌圈直徑總和與各水平之間的關(guān)系

3 小結(jié)

1）通過(guò)形態(tài)觀察和染色、16SrDNA序列同源性分析等方法鑒定出從鹿糞便中分離出的菌株為枯草芽孢桿菌J-2。通過(guò)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得出芽孢桿菌

J-2產(chǎn)生抗真菌肽的水平由多個(gè)因素共同決定的，芽孢桿菌J-2抗真菌肽最佳發(fā)酵條件為500 mL的錐形瓶中加入150 mL初始pH為7.0的PDL（200）培養(yǎng)基，接入9%的液體菌種，在溫度為37℃條件下發(fā)酵24 h。

2）本研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下運(yùn)用搖床發(fā)酵芽孢桿菌產(chǎn)生抗真菌肽，并將其培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，若想得到更優(yōu)的發(fā)酵條件，還需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化。

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（本文責(zé)編：陳偉）

Research on Identification of Bacillus J-2 from Deer Feces and Fermentation Conditions of Antifungal Peptide

ZHAI Yi，LIANG Xiao-bo
（Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Kunming Yunnan 650500，China）

In this study，with a strain of bacillus from deer feces as the test strains，we identified it as Bacillus subtilis J-2 by morphology，gram stain，spore stain，physiological and biochemical experiments，and it is analyzed，compared and identified by 16S rDNA sequence at the molecular level.the major factors which impact Bacillus J-2 generating antifungal peptides is analyzed by orthogonal optimization experiments，the optimum fermentation conditions of Bacillus J-2 generating antifungal peptides is derived，in 500 mL erlenmeyer flask is added 150 mL initial pH 7.0 PDL（200）medium access 9%liquid spawn，at the temperature of 37℃for fermentation.24 h.

Bacillus；Identification；Antifungal peptides；Fermentation

S852.61

A

1001-1463（2015）04-0011-07

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.04.004

2015-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金“Rib蛋白在羅伊氏乳桿菌腸道粘附中的功能研究”（31360022）

翟藝（1990—），女，山東青島人，碩士，主要從事菌種分離鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化、蛋白純化及表達(dá)研究工作。聯(lián)系電話：（0）18314341075。E-mail：761671135@qq.com

梁小波（1974—），男，陜西咸陽(yáng)人，副教授，博士，主要從事細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的功能研究工作。聯(lián)系電話：（0）13211649827。E-mail：xbliangkmust@hotmail.com