李正軍，程顯好，陳蒙蒙，孫 磊，李維煥

（魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院山東省食用菌技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264025）

核桃殼與棉籽殼對蜜環(huán)菌菌索生長的影響比較*

李正軍，程顯好**，陳蒙蒙，孫 磊，李維煥

（魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院山東省食用菌技術(shù)重點實驗室，山東 煙臺 264025）

探究核桃殼與棉籽殼對蜜環(huán)菌菌索生長的影響。在瓶栽和袋栽栽培過程中，采用單因素試驗結(jié)合統(tǒng)計分析方法比較不同栽培原料的栽培效果。實驗表明，菌索平均生長速度在核桃殼與麥麩培養(yǎng)料處理中生長最快；核桃殼與棉籽殼組合次之；棉籽殼與麥麩組合最慢。在蜜環(huán)菌培養(yǎng)過程中，進一步采用核桃殼與麥麩為主要原料，且比例為4:6時，可以明顯促進蜜環(huán)菌菌索生長，而且可以縮短生長周期，提高產(chǎn)量。新的培養(yǎng)方法可用于蜜環(huán)菌菌索生產(chǎn)，為天麻和豬苓提供優(yōu)質(zhì)伴栽材料。

蜜環(huán)菌；菌索；固體培養(yǎng)；棉籽殼；核桃殼

蜜環(huán)菌（Armillariella mellea），俗稱榛蘑，為擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）白蘑科（Tricholomataceae）真菌，是世界范圍內(nèi)廣泛存在的森林病原菌[1]，同時蜜環(huán)菌是一種珍貴的大型藥 (食)真菌，是中藥天麻（Gastrodia elata） 和豬苓（Polyporus umbellatus） 生長發(fā)育的必需伴生菌，有與天麻相似的藥用價值[2-3]。

蜜環(huán)菌野生資源日益減少，人工馴化有一定的困難，到目前為止還沒有商業(yè)性栽培生產(chǎn)的先例。國內(nèi)外研究多以闊葉原木培養(yǎng)為主，而此種培養(yǎng)方式存在浪費森林資源、成本高、生產(chǎn)周期長、收益少等諸多弊端，對生態(tài)環(huán)境影響較大。因此，原有的生產(chǎn)模式不僅限制了蜜環(huán)菌自身的利用，還阻礙其伴栽天麻等的生產(chǎn)效率及生產(chǎn)規(guī)模，導(dǎo)致天麻在生產(chǎn)中的品種退化、產(chǎn)量不穩(wěn)、質(zhì)量降低[4]。棉籽殼和核桃殼都是農(nóng)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物，來源廣泛，價格便宜，研究其作為蜜環(huán)菌菌索培養(yǎng)的材料，具有推廣應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試菌種

蜜環(huán)菌菌種，由魯東大學(xué)菌物科學(xué)與技術(shù)研究院菌種保藏中心提供。

1.1.2母種培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.3原種培養(yǎng)基

GPY培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨6 g、酵母浸粉10 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然。

1.1.4栽培培養(yǎng)基

核桃殼、棉籽殼、麥麩等為主要原料，調(diào)節(jié)組分含量，配置不同的比例。

1.2實驗設(shè)計

1.2.1探究不同培養(yǎng)料對蜜環(huán)菌菌索生長的影響

在熟悉蜜環(huán)菌生長特性的基礎(chǔ)上，本著來源廣泛、價格低廉、營養(yǎng)豐富等原則，尋找適合蜜環(huán)菌生長的培養(yǎng)料。由于供試原料有多種，本文只列出幾種較具代表性的培養(yǎng)料，設(shè)計不同的試驗配方，各組處理配方如表1。每組處理3瓶。每瓶裝干料0.5 kg，含水量60%。通過觀察記錄菌索生長速度、生長勢，確定最佳培養(yǎng)料成分。

1.2.2探究核桃殼與麥麩不同比例對蜜環(huán)菌菌索生長的影響

表1 不同培養(yǎng)料配方Tab.1　Formulae of different culture medium in this study

在確定最佳培養(yǎng)料的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的核桃殼與麥麩比例梯度。各組處理配方見表2。每組處理3瓶。每瓶裝干料0.5 kg，含水量60%。通過觀察記錄菌索生長速度、生長勢以確定最佳配方。

表2　核桃殼與麥麩不同比例培養(yǎng)料配方Tab.2　Culture medium of different proportion of walnut shell and wheat bran

1.3實驗方法

1.3.1母種的制作

采用PDA培養(yǎng)基，將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200 g切成小塊，加水煮爛（煮沸20 min～30 min，能被玻璃棒戳破即可），用4層紗布過濾，稍冷卻后再補足水分至1 000 mL，加入20 g葡萄糖，15 g～20 g瓊脂，充分溶解后，分裝試管，加塞、包扎，121℃滅菌20 min左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存。常規(guī)接種，于25℃培養(yǎng)15 d備用。

1.3.2原種的制作

采用GPY培養(yǎng)基，先把蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等按比例加水后，加熱并不斷攪拌，待瓊脂溶解，加入葡萄糖，攪拌，使其溶解，培養(yǎng)基配置好后，分裝三角瓶，加塞、包扎，121℃滅菌20 min左右后取出搖勻，冷卻后貯存。將低溫保存的蜜環(huán)菌母種接種于錐形瓶中，于25℃培養(yǎng)15 d備用。

1.3.3不同培養(yǎng)料對蜜環(huán)菌菌索生長的影響

培養(yǎng)料配制按表1，將核桃殼粉碎（小米粒大小即可），與其它培養(yǎng)料按照比例混勻，加水，使培養(yǎng)料含水量達到60%，裝瓶或裝袋，121℃滅菌2 h，自然冷卻后，接入蜜環(huán)菌原種，于25℃左右條件下暗培養(yǎng)。分別記錄各處理菌索長至培養(yǎng)料底部的時間，并計算出每組處理菌索生長速度，將各處理瓶相互比較，觀察菌索生長勢。菌索生長速度（V，mm·d-1）公式為：

V=H/T

式中：H表示培養(yǎng)料的高度（mm）；T表示菌索長至培養(yǎng)料底部的時間（d）。

1.3.4不同麥麩與核桃殼比例梯度對蜜環(huán)菌菌索生長的影響

培養(yǎng)料配制按表2，將核桃殼粉碎（小米粒大小即可），與其他培養(yǎng)料按照比例混勻，加水，使培養(yǎng)料含水量達到60%，裝瓶或裝袋，121℃滅菌2 h，自然冷卻后，接入蜜環(huán)菌原種，于25℃左右條件下暗培養(yǎng)。分別記錄各處理菌索長至培養(yǎng)料底部的時間，并計算出每處理菌索生長速度，將各處理瓶相互比較，觀察菌索生長勢。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件完成數(shù)據(jù)整理和計算；SPSS進行單因素方差分析；t-檢驗檢測相關(guān)系數(shù)的顯著差異性。

2　結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)料對蜜環(huán)菌生長的影響

不同培養(yǎng)料中蜜環(huán)菌菌絲生長勢、菌索生長速度等指標情況見表3。

2.1.1不同培養(yǎng)料處理間菌索生長勢比較

從表3可以看出蜜環(huán)菌可在各個處理中生長，但在核桃殼培養(yǎng)料中菌索生長勢最好，具體表現(xiàn)為菌索乳白色或褐色條狀，濃密，粗壯；而其它處理中菌索生長相對差一些，表現(xiàn)為菌索稀疏，纖細，顏色有的為深褐色，可能是有些老化的緣故。這表明，核桃殼與麥麩組合較其它培養(yǎng)料更加適合蜜環(huán)菌菌索生長。

2.1.2不同培養(yǎng)料處理間菌索生長速度比較

從表3可以看出，菌索在核桃殼與麥麩培養(yǎng)料處理中平均生長速度最快；核桃殼與棉籽殼組合次之；棉籽殼與麥麩組合最慢。菌索生長速度的方差分析見表4。

表3　不同培養(yǎng)料中蜜環(huán)菌菌絲生長情況比較Tab.3　Comparision on A.mellea growth in different culture materials

表4　蜜環(huán)菌菌索生長速度的方差分析Tab.4　Analysis of variance on the growth rate of A.mellea rhizomorph

通過表3菌索生長速度差異顯著性測驗和表4的方差分析表明，不同培養(yǎng)料處理間蜜環(huán)菌生長情況存在顯著差異。由表4可以看出，在培養(yǎng)料相同的情況下，不同梯度處理間差異不明顯。由于梯度為人為設(shè)置且僅有3個梯度，具體影響將在下面的試驗中分析討論。

綜上所述，蜜環(huán)菌在核桃殼與麥麩組合的固體培養(yǎng)基中，菌索生長勢良好，與其它組合相比更適合蜜環(huán)菌菌索的生長。因此在進一步的實驗過程中將著重探討不同的麥麩與核桃殼比例對蜜環(huán)菌營養(yǎng)生長的影響。

2.2不同麥麩與核桃殼比例對蜜環(huán)菌生長的影響

不同麥麩與核桃殼比例配方，對蜜環(huán)菌菌絲生長勢、菌索生長速度等指標影響見表5。

表5　不同麥麩與核桃殼比例配方中蜜環(huán)菌生長情況比較Tab.5　Comparison on growth of A.mellea in different ratio of wheat bran and walnut shell

2.2.1不同麥麩與核桃殼比例配方間蜜環(huán)菌菌索生長勢比較

從表5可以看出，配方D4～D8中菌索生長總體良好，具體表現(xiàn)為菌索乳白色條狀，濃密，粗壯；而其他處理的菌索生長情況相對差一些，菌索生長比較濃密，有些纖細，呈白色條狀或細根狀。

2.2.2不同麥麩與核桃殼比例配方間蜜環(huán)菌菌索平均生長速度比較

從表5可以看出，蜜環(huán)菌可在各個配方中生長，但菌索生長速度隨著麥麩與核桃殼比例的增加，菌索生長速度逐漸加快，當(dāng)比例達到6:4（配方D7）時菌索生長速度最快，此后，隨比例的增加，菌索生長速度逐漸減慢。不同麥麩與核桃殼比例配方中蜜環(huán)菌菌索生長速度方差分析見表6。

通過表6分析表明，各處理間菌索生長速度存在差異，且根據(jù)試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析得出，菌索平均生長速度與原料比例的相關(guān)系數(shù)為r＞0.754，相關(guān)達到顯著水平。D6～D8處理組中蜜環(huán)菌菌索生長良好。

3　結(jié)論與討論

本實驗中，通過不同種類的C源影響蜜環(huán)菌菌索生長的結(jié)果可以看出，核桃殼與其他C源相比，能夠促進蜜環(huán)菌菌索的生長。將核桃殼作為蜜環(huán)菌菌索生長的C源，能夠促進菌索的萌發(fā)以及生長，為蜜環(huán)菌子實體的萌發(fā)及其伴栽菌 (如天麻等)的生長提供必要條件。

不同藥（食）真菌的生長發(fā)育對營養(yǎng)物質(zhì)有著大致相似的要求，營養(yǎng)物質(zhì)包括C源、N源、無機鹽和生長素類。有研究表明蜜環(huán)菌生長在對氮源的利用上，不管無機氮還是有機氮，蜜環(huán)菌生長速度差別小于不同C源之間的差別，蜜環(huán)菌對不同C源的利用能力有較大差別。蜜環(huán)菌對糖的利用明顯優(yōu)于相應(yīng)的糖醇[5]。因此，選擇合適的C源是促進蜜環(huán)菌菌索生長的前提。張海珠等[6]通過核桃殼處理發(fā)現(xiàn)，其殼多糖由D-甘露糖、鼠李糖、半乳糖、D-半乳糖醛酸、葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-阿拉伯糖等11種單糖組成。正是由于核桃殼豐富的糖類為蜜環(huán)菌菌索的生長提供了生長所必需的C源，從而保證了蜜環(huán)菌菌索的生長。

另外，本實驗中通過設(shè)計不同培養(yǎng)原料比例梯度發(fā)現(xiàn)不同的碳氮比對蜜環(huán)菌營養(yǎng)生長也有顯著影響：配方D6～D8中，菌索生長狀態(tài)較好，生長速度較快。由此可以看出不同的碳氮比對蜜環(huán)菌的營養(yǎng)生長，即菌索的生長具有較大的影響。

表6　不同麥麩與核桃殼比例配方中菌索生長速度方差分析Tab.6　Variance analysis on growth rate of A.mellea rhizomorph in different ratio of wheat bran and walnut shell

核桃殼的主要成分有木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等碳水化合物。謝夏陽[7]發(fā)現(xiàn)碳氮源對菌種產(chǎn)纖維素酶的能力有影響，不同菌種產(chǎn)纖維素酶對碳氮源的要求不同；另外，范寰等[8]發(fā)現(xiàn)真菌降解木質(zhì)素能力源于其所產(chǎn)生的酶系統(tǒng)，而C源和N源以及其比例是其降解木質(zhì)素和產(chǎn)酶的一個極為重要的影響因素，木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶是分解木質(zhì)素的主要酶系，不同碳氮源以及不同的比例對分解木質(zhì)素酶的產(chǎn)生有很大影響，從而影響了真菌利用木質(zhì)素的能力。通過以上研究，可以表明合適的C源、N源，以及適宜的碳氮比，可以保證真菌體內(nèi)分解纖維素以及木質(zhì)素等酶系的產(chǎn)生，從而更好地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，保證自身的生長。蜜環(huán)菌作為真菌的一種，在其生長的過程中，可以合成分解纖維素與木質(zhì)素的酶系。通過選擇合適的碳氮源以及最佳的比例，可以很好地促進酶系的產(chǎn)生，從而可以更好地利用培養(yǎng)基中的C源和N源，促進蜜環(huán)菌菌索的生長。

本實驗中，在以核桃殼為C源的培養(yǎng)基中，蜜環(huán)菌菌索生長濃密，粗壯，呈現(xiàn)樹根狀乳白色或淺褐色，生長速度較快。除了上述分析的原因之外，還可能是由于核桃殼中某種特定的糖類含量比較高而促進了菌索的生長；或者是核桃殼中某種特殊的物質(zhì)對蜜環(huán)菌菌索的生長具有刺激作用，比如核桃醌、氫化胡桃醌、β－葡萄糖甙、鞣質(zhì)、沒食子酸等，這些有機類物質(zhì)是一般碳源所缺乏的；亦或是核桃殼中某種微量元素的含量比較高，從而大大促進了蜜環(huán)菌菌索的生長，使其呈現(xiàn)粗壯、濃密的生長勢。具體原因還需要進一步的探討和驗證。

野生蜜環(huán)菌資源日益減少，阻礙了蜜環(huán)菌以及其伴栽豬苓和天麻的開發(fā)與利用。而由于蜜環(huán)菌生長需要菌材以及在人工合成培養(yǎng)基中不能很好地生長等原因?qū)е旅郗h(huán)菌人工馴化困難[9]。天麻和豬苓作為重要的中藥材品種，其生長過程都離不開蜜環(huán)菌。蜜環(huán)菌為天麻或豬苓的生長提供的營養(yǎng)成分中，碳源成分應(yīng)當(dāng)是交換量最大的部分。蜜環(huán)菌固體培養(yǎng)特性表明，其極易利用甘露糖而不易利用甘露醇[5]，所以在菌體中積累了較多量的甘露醇。楊峻山等[10]從蜜環(huán)菌的菌絲中分離得到了甘露醇和赤蘚醇等糖醇類成分，由此可以推測甘露醇有可能是蜜環(huán)菌為其伴栽豬苓或天麻提供的主要碳源營養(yǎng)。因此，實現(xiàn)蜜環(huán)菌的人工馴化和高產(chǎn)是開發(fā)蜜環(huán)菌及其伴栽資源的首要條件。

本研究將核桃殼用于蜜環(huán)菌的營養(yǎng)生長，為蜜環(huán)菌子實體的萌發(fā)以及其伴栽豬苓、天麻的生長提供了必要條件。由于核桃殼價格低廉，屬于易獲得的產(chǎn)品加工下腳料，從而克服了現(xiàn)有蜜環(huán)菌栽培技術(shù)的諸多弊端，打破了蜜環(huán)菌闊葉樹木木段培養(yǎng)的傳統(tǒng)觀念，在低投入的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)高收益，而且具有菌胚全部綜合利用、無廢棄物等優(yōu)點。以節(jié)約資源、綠色環(huán)保、變廢為寶的理念為蜜環(huán)菌乃至天麻等伴生真菌的人工栽培開辟新道路、新思維。

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Influence Comparison of Cotton Seed Shell and Walnut Shell on the Growth of Armillariella mellea Rhizomorph

LI Zheng-jun,CHENG Xian-hao,CHEN Meng-meng,SUN Lei,LI Wei-huan
(Ludong University Institute of Mycological Science and Technology,Shandong Province Fungal Product Development Lab, Yantai 264025,China)

The influence of cotton seed shell and walnut shell on the growth ofArmillariella mellearhizomorph was studied.In the cultivition process of bottle culture and bag culture,the single factor test was used to explore the influence of each parameter.Rhizomorph average growth rate was the fastest in the walnut shell with wheat compost,and rhizomorph average growth rate was the slowest in the cotton seed shell with wheat compost.When the ratio of walnut shell and wheat was 4∶6,it could promote the growth of rhizomorph and shorten the growth time of A.mellea rhizomorph.The new method could be used to A.mellearhizomorph cultivation.It was also used for the cultivition ofRhizoma gastrodiaeandPolyporus umbellatus.

Armillariella mellea;rhizomorph;solid cultivation;cotton seed shell;walnut shell

S646.9A1003-8310（2015）05-0029-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.008

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊（SDAIT-11-011-11）。

李正軍（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向為蜜環(huán)菌的栽培研究。E-mail:lzj68687@126.com

**通信作者：程顯好（1966-），男，博士，教授，主要從事菌物資源與開發(fā)等研究。E-mail:chengxianhao@sohu.com

2015-07-22