眼針與體針對腹瀉型腸易激綜合征大鼠下丘腦及結(jié)腸組織P物質(zhì)及神經(jīng)激肽Ⅰ型受體表達的影響

劉旭東王路王艷杰王哲柴紀嚴王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110847)

摘要〔〕目的觀察比較眼針及體針對腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)大鼠下丘腦及結(jié)腸組織P物質(zhì)(SP)及神經(jīng)激肽Ⅰ型受體(NK-1)表達的影響。方法將40只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、眼針組、體針組4組，每組10只。采用慢性應(yīng)激結(jié)合束縛方法建立IBS 大鼠模型。眼針組取下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)進行針刺，治療7 d。用免疫組化方法檢測大鼠下丘腦及結(jié)腸組織中SP和NK-1蛋白的表達；用RT-PCR方法檢測大鼠下丘腦及結(jié)腸組織中SP mRNA的表達。結(jié)果與模型組比較，眼針組大鼠下丘腦和結(jié)腸組織SP和NK-1蛋白的表達以及SP mRNA的表達均明顯減少(P<0.01)。結(jié)論眼針療法優(yōu)于體針，對D-IBS有治療作用。

關(guān)鍵詞〔〕P物質(zhì)； NK-1受體；眼針；下丘腦

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃973自助項目(2007CB512702)

通訊作者：王德山(1951-)，男，教授，主要從事中醫(yī)藥對消化系統(tǒng)神經(jīng)內(nèi)分泌功能影響的研究。

第一作者：劉旭東(1980-)，男，講師，碩士，主要從事消化道生理研究。

Effects of eye-acupuncture and acupuncture on expressions of SP and NK-1 receptors in hypothalamus in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome

LIU Xu-Dong, WANG Lu, WANG Yan-Jie,etal.

Basic Medicine College, Liaoning University of TCM, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effect of the eye-acupuncture therapy on hypothalamus and colonic substance P (SP) and NK-1 receptors contents in rats with diarrhea-predominanirritable bowel syndrome (D-IBS) and explore its related mechanism.MethodsForty male Wistar rats were equally randomized into control, IBS model, eye-acupuncture and acupuncture groups. IBS model was established by giving the rat with chronic stress stimulation (cold-water swimming, tail clamping, electrical shock, etc.) for 18 days. Eye-acupuncture of Xiajiao (Low Energizer) Area, Pi (Spleen) Area, Gan (Liver) Area and Dachang (Large Intestine) Area were given to the rat for 20 min, twice daily for 7 d. The expressions of SP mRNA and NK-1 mRNA were measured by RT-PCR, and the expressions of SP and NK-1 protein were detected by immunohistochemistry. ResultsCompared with the model group, the expressions of SP mRNA,NK-1 mRNA and SP, NK-1 protein in rat hypothalamus and colon after the eye acupuncture therapy were both obviously decreased (P<0.01).ConclusionsEye-acupuncture could reduce hypothalamus and colonic SP and NK-1 contents in D-IBS rats, which might play a role in relieving IBS in eye-acupuncture clinic.

【Key words】SP；NK-1 receptor;Eye acupuncture；Hypothalamus

腹瀉型腸易激綜合征(D-IBS)作為腸易激綜合征的一種亞型，是腹痛或腹部不適伴以腹瀉為主要排便習(xí)慣異常的常見胃腸功能紊亂疾病。臨床實踐證明，眼針對胃腸運動功能具有較好的調(diào)整作用，在應(yīng)用眼針防治D-IBS取得良好效果〔1〕。本課題利用D-IBS大鼠模型，觀察眼針及體針療法D-IBS大鼠模型海馬和結(jié)腸組織中P物質(zhì)(SP)和神經(jīng)激肽Ⅰ型受體(NK-1)含量的影響，探討眼針對IBS 治療的作用機制。

1材料與方法

1.1動物與分組健康SPF級SD大鼠40只，北京維通利華實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2007-0001。雌雄不拘，體質(zhì)量(280±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由飲水、攝取標準顆粒飼料，室內(nèi)溫度22 ℃，相對濕度45%。按隨機數(shù)字表法將SD 大鼠分為正常組、模型組、眼針組、體針組4 組，每組10只。

參考文獻1.2IBS 模型的建立除正常組外其余大鼠均采用慢性應(yīng)激結(jié)合束縛方法建立IBS模型?！?〕的方法并作改進，在18 d中讓大鼠隨機循環(huán)接受6種不同的應(yīng)激刺激，包括：冷水游泳(14℃，5 min)，夾尾(180 s)，禁水(24 h)，禁食(24 h)，電擊(電壓為30 V，電擊5 s，間歇5 s，共進行120 s)，高溫(溫箱中，40℃，30 min)，每天隨機接受1種刺激，18 d內(nèi)平均每種刺激3次。同時參考文獻〔3〕的方法，每天給予大鼠30%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，用膠帶束縛其前肩、前上肢及胸部，限制其搔抓頭面部，束縛1 h 。

1.3取穴及刺法眼針組：造模結(jié)束后開始治療。用31號13 mm毫針，于大鼠眼眶周圍2 mm處針刺，定位參照人體眼針取穴方法，取下焦區(qū)、大腸區(qū)、肝區(qū)、脾區(qū)。平刺進針3 mm，留針20 min，每12 h治療1次，每日治療2次，共針刺7 d。體針組：體針組左足三里，用31號13 mm毫針平刺進針3 mm，留針20 min，每12 h治療1，每日治療2次，共針刺7 d。

1.4試劑實時定量PCR 試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。SP及NK-1引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠SP及NK-1多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。SP引物序列：上游：5′-ATGAAAATCCTCGTGGCGGT-3′，下游：5′-CAGCATCCCGTTTGCCCATT-3′；NK-1引物序列：上游：5′-ATGCCCAGCAGAGTCGTGTG-3′，下游：5′-CAGTGTACGCGTAGCCGATCA-3′。

1.5指標測定及方法采用RT-PCR方法檢測大鼠結(jié)腸及下丘腦SP mRNA表達，免疫組化檢測大鼠結(jié)腸、下丘腦SP、NK-1蛋白表達。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較行方差分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠結(jié)腸組織SP及NK-1表達水平比較與正常組SP mRNA(0.15±0.06)和蛋白(0.171±0.022)比較，模型組結(jié)腸SP mRNA及蛋白表達水平顯著升高(0.66±0.21，0.262±0.019，P<0.01)；和模型組比較，眼針組SP mRNA及蛋白(0.34±0.10,0.214±0.023)、體針組結(jié)腸SP mRNA及蛋白(0.22±0.09、0.231±0.017)表達水平顯著降低(P<0.01)。與正常組NK1蛋白(0.215±0.014)比較，模型組大鼠結(jié)腸NK-1蛋白(0.246±0.015)表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，眼針組(0.223±0.015)和體針組大鼠結(jié)腸NK-1蛋白(0.230±0.015)的表達水平顯著降低(P<0.01)；與眼針組相比，體針組無顯著差異(P>0.05)。見圖1～圖3。

2.2各組大鼠下丘腦SP和NK-1 mRNA及蛋白表達水平的比較和正常組SP mRNA及蛋白表達(0.17±0.02、0.181±0.020)比較，模型組大鼠下丘腦SP mRNA及蛋白表達水平顯著升高(0.48±0.05、0.234±0.009，P<0.01)；和模型組比較，眼針組大鼠下丘腦SP mRNA及蛋白表達水平顯著降低(0.37±0.07、0.216±0.010,P<0.01)，體針組SP mRNA及蛋白表達水平顯著降低(0.41±0.04、0.209±0.009,P<0.05)；和眼針組比較，體針組SP mRNA及蛋白表達水平無顯著差異(P>0.05)。見圖4，圖5。

與正常組相比，模型組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平升高(0.228±0.007 vs 0.201±0.007，P<0.01)，與模型組相比，眼針組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平降低(0.215±0.006,P<0.01)，體針組無顯著差異(0.224±0.010,P>0.05)；與眼針組相比體針組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖6。

M為Marker，1～3泳道為正常組，4～6泳道為模型組，7～9泳道為眼針組，10～12泳道為體針組 圖1　各組大鼠結(jié)腸組織SP mRNA表達

圖2　各組大鼠結(jié)腸SP蛋白表達(DAB，×400)

圖3　各組大鼠結(jié)腸NK-1蛋白表達(DAB,×400)

M為Marker，1～3泳道為正常組，4～6泳道為模型組，7～9泳道為眼針組，10～12泳道為體針組 圖4　各組大鼠下丘腦SP mRNA表達

圖5　各組大鼠下丘腦 SP蛋白表達(DAB，×400)

圖6　各組大鼠下丘腦NK-1蛋白表達(DAB，×400)

3討論

眼針療法是根據(jù)眼球結(jié)膜上血管的形色變化，判斷疾病的性質(zhì)與部位，然后辨證針刺眼周穴，以治療全身疾病的一種方法〔4〕。眼針的理論基礎(chǔ)源于“十二經(jīng)脈三百六十五絡(luò)，其血氣皆上于面而走空竅，其精陽氣上走于目而為睛”，即眼周八區(qū)十三穴與周身十二經(jīng)脈有密切聯(lián)系，針刺眼周十三穴可以調(diào)整十二經(jīng)脈的功能，從而取得療效〔5〕。IBS 是一組以腹痛或腹部不適，同時伴有排便習(xí)慣改變和(或) 大便性狀異常為主要癥狀的腸道功能性疾病。近年來發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)叢功能失調(diào)，導(dǎo)致腦腸軸功能異常，可能是IBS 患者對各種應(yīng)激反應(yīng)增強和內(nèi)臟敏感性增加的主要原因。腦腸肽在調(diào)節(jié)腦腸軸功能方面起著重要的作用，具有激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重性。SP 是目前研究較多的腦腸肽，在胃腸道功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，有研究表明SP通過激活NK-1受體和NK-2受體，刺激直腸黏膜的離子交換與IBS的發(fā)生相關(guān)。最近已發(fā)現(xiàn)多種速激肽受體(P物質(zhì)受體)拮抗劑，如TAK-637對IBS具有治療作用〔6〕。SP能纖維主要分布在腸壁肌層〔7〕。SP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在消化道的運動和分泌中起著重要作用，能夠加速胃腸蠕動，促進胃腸道平滑肌收縮和胃腸道運動，加強結(jié)腸的集團推進運動，使患者排便次數(shù)增多。SP在IBS的應(yīng)激、腸道感染、內(nèi)臟敏感性增高及與之相關(guān)的神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌調(diào)控機制中均有重要作用〔8，9〕。本文結(jié)果表明，眼針療法能夠降低IBS 模型大鼠結(jié)腸組織及下丘腦NK-1和SP的表達，改善了IBS發(fā)病過程中腦腸軸功能的異常，對IBS起到了治療作用，但體針組SP表達降低沒有眼針效果明顯，說明眼針刺激外周相關(guān)穴位，通過外周感受器與大腦皮層“點”對“點”的聯(lián)系，其傳出信息反射性啟動靶器官神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子等釋放和分泌，從而調(diào)控局部血運與代謝，改善其功能，達到治療效果。

4參考文獻

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〔2014-07-19修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)