陳 崇，周桃玉，溫旺榮

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州510630）

家族性和三陰性乳腺癌血清中miR-21的表達(dá)

陳 崇，周桃玉，溫旺榮

（暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州510630）

目的：檢測(cè)血清miR-21在乳腺癌中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步闡明miR-21在家族性和三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用．方法：收集健康女性體檢者、具有患乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)者、不同種類乳腺癌患者的血清．以線蟲(chóng)miR-39為外參，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)77份血清中miR-21的表達(dá)水平．結(jié)果：家族性乳腺癌組、三陰性乳腺癌組和乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)組血清miR-21水平顯著高于正常對(duì)照組、其他乳腺癌組（P＜0．01）．血清miR-21的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki67高表達(dá)有關(guān)（P＜0．01）．結(jié)果顯示血清miR-21表達(dá)量在家族性和三陰性乳腺癌中升高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67表達(dá)有關(guān)．結(jié)論：血清miR-21與三陰性、家族性乳腺癌的發(fā)生有緊密聯(lián)系，其表達(dá)增高與乳腺癌的遺傳性、惡性程度及預(yù)后判斷有關(guān)．

miR-21；家族性乳腺癌；三陰性乳腺癌；血清；熒光定量PCR

乳腺癌的發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤首位．中國(guó)乳腺癌的發(fā)病率以每年3%～4%的速度增長(zhǎng)，現(xiàn)在已成為女性癌癥死亡的主要原因．乳腺癌是一種具有明顯遺傳特征的惡性疾病，是環(huán)境、遺傳等因素共同作用的結(jié)果［1］．中國(guó)家族性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～25%．而三陰性乳腺癌（雌激素、孕激素受體與人表皮生長(zhǎng)因子受體-2均為陰性者）占所有乳腺癌的約15%～20%，且擁有比其他類型的乳腺癌更高的復(fù)發(fā)率和更差的預(yù)后．近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證據(jù)表明microRNA可以作為檢測(cè)癌癥存在和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物．其中miR-21在癌癥患者中的表達(dá)量的改變最為常見(jiàn)［2］．2005年Iorio等［3］首次發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌組織的表達(dá)量明顯高于正常乳腺組織，Wang F等［4］發(fā)現(xiàn)miR-21在乳腺癌患者組織和血清中表達(dá)均有增高．因此，本研究選擇乳腺癌高危者和不同類型的乳腺癌，特別是家族性和三陰性乳腺癌患者血清中miR-21表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并分析其在家族性和三陰性乳腺癌中的發(fā)病作用．

1 材料和方法

1．1 研究對(duì)象

研究對(duì)象來(lái)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月至2014年5月門診、住院就診者．分為以下4組：A組為三陰性乳腺癌病人，共20例，平均年齡（53±1．33）歲；B組為家族性乳腺癌病人，共8例（已剔除三陰性的病例），平均年齡（49±1．98）歲；B2組為家族性乳腺癌病人的健康一級(jí)親屬（具有患乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)），共9例，平均年齡（37±4．12）歲；C組為其他乳腺癌病人（除三陰性及家族性乳腺癌），共20例，平均年齡（56±2．43）歲；D組為對(duì)照組，收集同期體檢者血清（入選標(biāo)準(zhǔn)是無(wú)腫瘤病史和臨床體征的健康女性），共20例，平均年齡（45±3．24）歲．收集血清后放置－80℃冰箱保存．

1．2 所用儀器和器材

Light Cycler1．5 Instrument羅氏實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x（德國(guó)Roche）；ABI Prism 7000熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；高速冷凍離心機(jī)（中國(guó)科技大學(xué)中佳公司）；Ⅱ級(jí)B2型生物安全柜（新加坡ESCO）；Biophotomet加樣槍（德國(guó)Eppendorf）；Biophotometer生物分光光度計(jì)（德國(guó)Eppendorf）．

1．3 主要試劑

Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen）；異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇（廣州達(dá)暉公司）；HmiR-21 Hairpin-itTMReal-Time PCR Kit和Cel-miR-39 Hairpin-itTMReal-Time PCR Kit（上海吉瑪公司）；線蟲(chóng)Cel-miR-39的雙鏈mimics（上海吉瑪公司）；RNA酶抑制劑（加拿大Thermo Fermentas）．

1．4 方法

（1）樣本準(zhǔn)備 用含促凝膠的真空采血管抽取研究對(duì)象4 mL外周靜脈血，待血液凝固后3 000 r／min離心10 min，取上層血清至1．5 mL EP管放－80℃冰箱保存．

（2）總RNA提取 血清樣本置冰上融化后，吸取250 μL加入1 mL Trizol中混勻，室溫放置5 min后，加入mimics 4 μL．加入200 μL氯仿，在漩渦混合器中劇烈振蕩15 s，置入離心機(jī)中4℃12 000 r／min離心15 min．將上層液相（約600 μL）吸出，加入500 μL異丙醇中顛倒混勻，室溫靜置10 min．4℃12 000 r／min離心10 min后，棄去上清液．用1 mL配好預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇（750 μL無(wú)水乙醇加250 μL DEPC處理水）反復(fù)洗滌RNA沉淀．4℃7 500 r／min離心5 min，棄去上清．開(kāi)蓋室溫干燥RNA沉淀25 min．加入30 μL DEPC處理水反復(fù)多次吹打混勻RNA沉淀，使其溶解．測(cè)定總RNA濃度，得到的總RNA純度范圍在1．8～2．0，濃度為25～50 ng／L．

（3）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol／L）0．75 μL，miR-21逆轉(zhuǎn)錄引物（1 μmol／L）1．2 μL，RNA酶抑制劑（40 U／μL）0．25 μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U／μL）0．2 μL，總RNA樣本5 μL，DEPC處理水8．6 μL．反應(yīng)設(shè)1個(gè)復(fù)孔．反應(yīng)條件為25℃30 min，42℃30 min，85℃5 min．外參Cel-miR-39逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系同上．陰性對(duì)照以生理鹽水代替提取的總RNA產(chǎn)物．

（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括2×Master Mix 10 μL（包含MgCl2，dNTPs、SYBR Green熒光染料）10 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物套裝（5 mol／μL）0．32 μL，Taq DNA聚合酶（5×106U／L）0．2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，DEPC處理水8．6 μL．反應(yīng)設(shè)1個(gè)復(fù)孔．反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃12 s、62℃40 s，40個(gè)循環(huán)．外參Cel-miR-39反應(yīng)體系同上．設(shè)置熔解曲線判斷是否有非特異性的擴(kuò)增和引物二聚體的出現(xiàn)．空白對(duì)照以生理鹽水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物．

（5）血清中miR-21表達(dá)量 PCR擴(kuò)增結(jié)果用Ct值來(lái)表示，Ct值的含義是PCR反應(yīng)中熒光信號(hào)達(dá)到所設(shè)定的閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)．目的基因的相對(duì)表達(dá)量（relative expression，RQ）用2－ΔΔCt表示［5］．ΔΔCt＝（標(biāo)本CtmiR－21－標(biāo)本CtCel－miR－39）－（對(duì)照CtmiR－21－對(duì)照CtCel－miR－39），健康體檢者標(biāo)本血清的miR－21作為對(duì)照．

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，相對(duì)表達(dá)量2－ΔΔCt成偏態(tài)分布且方差不齊，將2－ΔΔCt進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)單樣本K－S檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布（Z＝0．643，P＝0．803＞0．05），經(jīng)Levene檢驗(yàn)結(jié)果方差不齊（P＝0．007＜0．05）．采用單因素ANOVA分析多個(gè)樣本均數(shù)間比較，兩兩樣本間采用Tamhane's T2法檢驗(yàn)．在不同的乳腺癌臨床病理參數(shù)組之間的血清miR-21表達(dá)水平比較，用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異．

2 結(jié)果

2．1 miR-21和Cel-miR-39的熔解曲線

miR-21熔解曲線在79℃左右呈現(xiàn)單峰；CelmiR-39熔解曲線在81℃左右呈現(xiàn)單峰，且均無(wú)引物二聚體與雜峰存在，表明PCR反應(yīng)參數(shù)合適，擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物特異性較好（圖1）．

A：miR-21；B：miR-39；C：miR-21陰性質(zhì)控；D：miR-39陰性質(zhì)控．圖1 miR-21和Cel-miR-39的熔解曲線A：miR-21；B：miR-39；C：miR-21 negative control；D：miR-39 negative control．Fig．1 Melting curves for miR-21 and miR-39

2．2 各組血清miR-21的表達(dá)差異

（1）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 各組研究對(duì)象血清miR-21及Cel-miR-39的呈標(biāo)準(zhǔn)S型反應(yīng)曲線，陰性對(duì)照曲線呈不規(guī)則型，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線（圖2、圖3）．

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對(duì)照；N：陰性對(duì)照；K：空白對(duì)照．圖2 各組血清中miR-21實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control；N：negative control；K：blank control．Fig．2 The amplification curves of fluorescence quantitative PCR for serum miR-21 in different groups

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對(duì)照；N：陰性對(duì)照K：空白對(duì)照．圖3 各組血清中Cel-miR-39的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control；N：negative control；K：blank control．Fig．3 The amplification curves of fluorescence quantitative PCR for exogenous internal reference miR-39 in different groups

（2）正常對(duì)照、乳腺癌A、B、B2、C組的血清miR-21表達(dá)水平比較 以ΔCt表示標(biāo)本miR-21的表達(dá)量．當(dāng)ΔCt值越低，說(shuō)明miR-21在研究對(duì)象體內(nèi)表達(dá)量越高，檢測(cè)結(jié)果顯示了血清miR-21的表達(dá)量．所有研究對(duì)象血清樣本中的miR-21、miR-39檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1．

表1 血清miR-21在正常對(duì)照與不同乳腺癌分組中表達(dá)差異1）Table 1 Differential expression of serum miR-21 in healthy control group and various of breast cancer groups（±s）

表1 血清miR-21在正常對(duì)照與不同乳腺癌分組中表達(dá)差異1）Table 1 Differential expression of serum miR-21 in healthy control group and various of breast cancer groups（±s）

1）數(shù)據(jù)不成正態(tài)分布采用M（P25，P75）表示．

組別nmiR-21 CtCel-mir-39 Ct2－ΔΔCt1）log102－ΔΔCtA組2025．39±1．5912．11±0．874．00（2．32，11．71）0．67±0．57 B組823．86±1．8411．77±0．9412．87（2．63，56．59）1．06±0．74B2組925．13±0．8011．76±0．654．26（2．97，5．98）0．64±0．19 C組2026．45±1．5911．02±0．800．58（0．38，1．14）－0．16±0．30 D組2027．97±0．7612．46±1．010．76（0．54，1．79）0．00±0．40

經(jīng)單因素ANOVA方差分析，比較5組間的相對(duì)表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝17．11，P＝0．00＜0．01），進(jìn)一步使用Tamhane's T2法檢驗(yàn)做各個(gè)分組間的比較，三陰性乳腺癌組、家族性乳腺癌組血清miR-21水平顯著高于正常對(duì)照組和其他乳腺癌組（P＜0．01）；乳腺癌高危組血清miR-21水平顯著高于正常對(duì)照組和其他乳腺癌組（P＜0．01）；三陰性乳腺癌組、家族性乳腺癌組和乳腺癌高危組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；正常對(duì)照組與其他乳腺癌組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（圖4）．

2．3 血清miR-21的表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

乳腺癌血清中miR-21相對(duì)表達(dá)量與腫瘤單側(cè)或雙側(cè)發(fā)生（P＝0．679）、年齡（P＝0．245）、CA153（P＝0．893）、月經(jīng)狀況（P＝0．717）無(wú)明顯關(guān)系，各分組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）．乳腺癌血清中miR-21相對(duì)表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0．000）、Ki67（P＝0．006）呈正相關(guān)（表2），P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5、6）．

A：三陰性乳腺癌；B：家族性乳腺癌；B2：乳腺癌高危者；C：其他乳腺癌；D：正常對(duì)照．圖4 各組血清中miR-21表達(dá)量（n＝77）比較A：triple negative breast cancer；B：familial breast cancer；B2：high risk for breast cancer C：other breast cancer；D：healthy control．Fig．4 The serum miR-21 expression levels in different groups

表2 血清miR-21表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Table 2 Assocation of miR-21 expression with clinical and pathological features

圖5 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與血清miR-21表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Fig．5 Assocation of miR-21 expression with lymph nod metastasis

圖6 Ki67與血清miR-21表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖Fig．6 Assocation of miR-21 expression with ki67

3 討論

微小RNA（miRNA）是內(nèi)源性非編碼的小型核糖核酸，廣泛存在于動(dòng)物、植物和病毒中，能夠與特定的目標(biāo)mRNA中序列互補(bǔ)配對(duì)，并在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯，參與生物體的生理、病理過(guò)程．研究表明循環(huán)中miRNA與腫瘤的臨床病理特征密切相關(guān)，其表達(dá)情況可以用于惡性腫瘤的診斷、預(yù)后判斷和治療．

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人體血清中miRNA的表達(dá)量，消除在RNA提取過(guò)程中樣品間的差異十分關(guān)鍵，之前大多數(shù)研究都選擇內(nèi)參如U6來(lái)達(dá)到這一作用，但是內(nèi)參在人體疾病狀態(tài)下是否影響表達(dá)量也暫不可知，并且在血清中來(lái)源與表達(dá)目前為止仍然存在許多不清楚的因素．本實(shí)驗(yàn)引入人工合成的線蟲(chóng)miR-39作為外源性的內(nèi)參，由于人體血清中不含有此序列且影響因素少，并且這一做法已得到驗(yàn)證［6］．

已有研究證明，miR-21編碼基因位于17q23．2［7］．在結(jié)腸癌［8］、肺癌［9］、胃癌［10］、乳腺癌［11］等多種腫瘤中表達(dá)異常．miR-21在乳腺癌組織高于正常乳腺組織中的表達(dá)水平，其表達(dá)水平與一些臨床和病理特征相關(guān)［12－14］．而且國(guó)內(nèi)外學(xué)者已研究關(guān)注人體血液循環(huán)中miR-21，并認(rèn)為血清中miR-21表達(dá)升高對(duì)惡性腫瘤的早期診斷［2］、早期治療［15］、腫瘤轉(zhuǎn)移［11］、腫瘤惡化［16］和預(yù)后［2］等方面具有預(yù)測(cè)價(jià)值．因此，本組對(duì)乳腺癌患者血清miR-21進(jìn)行臨床研究．

本研究主要對(duì)正常人、乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)人群、乳腺癌患者血清miR-21的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并分析比較之間差異．檢測(cè)結(jié)果表明，家族性乳腺癌組的血清miR-21表達(dá)水平在所有分組中最高；且家族性乳腺癌組、三陰性乳腺癌組和乳腺癌高危組血清miR-21的表達(dá)量均高于其他乳腺癌組和正常對(duì)照組（P＜0．05）．王責(zé)年等的研究也顯示［17］血清miR-21在乳腺癌患者血清呈高表達(dá)；Wang B等［13］使用SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常對(duì)照和乳腺癌病人血清中miR-21的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-21在癌癥患者血清中顯著增高（P＜0．001）．上述兩個(gè)研究結(jié)論與本文結(jié)果一致，但存在一定差異，差異在于上述兩個(gè)研究中家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌都?xì)w入乳腺癌組，但本研究將家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌患者區(qū)分出來(lái)研究分析，所以本文的結(jié)論為正常對(duì)照組與其他乳腺癌組的差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而家族性乳腺癌和三陰性乳腺癌組均升高．正如Radojicic J［18］等研究中，miR-21在原發(fā)性三陰性乳腺癌患者中高表達(dá)，與本研究相一致．

本研究還發(fā)現(xiàn)9例家族性乳腺癌患者的一級(jí)健康親屬血清中miR-21表達(dá)量增高，與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）．miR-21在乳腺癌高危者血清中高表達(dá)結(jié)合乳腺癌家族史可望用于預(yù)測(cè)患乳腺癌高風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)然這一結(jié)論還需增加樣本量進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證．

48例乳腺癌組患者血清miR-21的檢測(cè)結(jié)果與乳腺癌臨床病理參數(shù)結(jié)果顯示，血清miR-21的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0．000）、Ki67（P＝0．006）經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．乳腺癌患者血清miR-21高表達(dá)不僅與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki67表達(dá)有關(guān)．說(shuō)明miR-21與乳腺癌的轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性．Ki67抗原是一種在增殖細(xì)胞中表達(dá)的核抗原，能反映腫瘤的增殖活性［19］．Ki67抗原的過(guò)量表達(dá)與乳腺癌的惡性生物學(xué)行為和預(yù)后有密切聯(lián)系，并可以作為確定癌前人群中高危個(gè)體的生物學(xué)標(biāo)志物．Ki67與miR-21表達(dá)的正相關(guān)，預(yù)測(cè)miR-21在判斷乳腺癌惡性程度、腫瘤的增殖能力、預(yù)測(cè)高危風(fēng)險(xiǎn)也存在一定價(jià)值．

血清miR-21與家族性和三陰性乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其表達(dá)增高對(duì)乳腺癌的遺傳性、惡性程度及其預(yù)后相關(guān)，具體機(jī)制有待探討．至于血清miR-21能否作為該種乳腺癌診斷指標(biāo)、預(yù)測(cè)指標(biāo)和與BRCA1基因突變的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究．

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［責(zé)任編輯：陳詠梅］

The expression of serum miR-21 in the patients with familial breast cancer and triple negative breast cancer

CHEN Chong，ZHOU Taoyu，WEN Wangrong
（Center of Clinical Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510630，China）

Aim：To detect differences of serum miR-21 expression in breast cancer patients in order to further clarify the role of miR-21 in the pathogenesis of familial and triple negative breast cancers．Methods：The serum of healthy female volunteers，other types of breast cancer patients and high risk volunteers for breast cancer were collected．The expression levels of miR-21 in sera from 77 patients or volunteers were determined by fluorescence quantitative PCR．And Cel-miR-39 was used as exogenous internal reference．Results：The relative expression level of serum miR-21 was significantly higher in familial breast cancer groups、triple negative breast cancer group and high risk group than that in healthy control group or other breast cancer group（P＜0．01）．The expression of serum miR-21 was associated with lymph nod metastasis and Ki67 expression level（P＜0．01）．The results showed that serum miR-21 of patients with familial and triple-negative breast cancer，and was revelant with lymph node metastasis and Ki67 expression．Conclusion：Serum miR-21 of patients with breast cancer may be associated with hereditary，the degree of malignancy and determination of prognosis．

miR-21；familial breast cancer；triple negative breast cancer；serum；FQ-PCR

R737．9

A

1000－9965（2015）01－0050－07

10．11778／j．jdxb．2015．01．009

2014－11－12

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031800315）

陳 崇（1989－），女，技師，研究方向：臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)

溫旺榮，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：020－38688430，E-mail：wenwangrong＠yeah．net