杜 鵑， 趙洪霞， 陳景文

（工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，大連理工大學環(huán)境學院，遼寧 大連116024）

近年來，醫(yī)藥和個人護理化學品（PPCPs）作為一類新型污染物因其對環(huán)境存在的潛在危害引起了廣泛的關(guān)注［1-3］?？股刈鳛橐活惓Ｒ姷腜PCPs，除了用于疾病的治療和預(yù)防外，也被大量地用于畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖。抗生素可通過污水處理廠出水、醫(yī)藥廢水、養(yǎng)殖廢水等多種途徑進入環(huán)境［4，5］。環(huán)境中存在的抗生素可誘導(dǎo)細菌出現(xiàn)抗藥性，影響生態(tài)平衡［6，7］，人體接觸環(huán)境中殘留的抗生素可引起過敏反應(yīng)和增加癌癥發(fā)病風險［8］。

由于環(huán)境基質(zhì)復(fù)雜多樣，環(huán)境中抗生素的分析受到了挑戰(zhàn)，而目前沒有可用于環(huán)境樣品中多種抗生素分析的標準方法。已有的抗生素分析方法包括薄層色譜法、毛管電泳法、酶聯(lián)免疫法和結(jié)合固相萃?。⊿PE）的色譜分析［9-18］，如高效液相色譜-紫外／熒光檢測（HPLC-DAD／FLD）［12，13］、高效液相 色譜-質(zhì) 譜（HPLC-MS）［14，15］、高 效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜（HPLC-MS／MS）［16，17］及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS／MS）［18］等。由 于 基 于 多 反 應(yīng) 監(jiān) 測（MRM）模式的HPLC-MS／MS 技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、線性動態(tài)范圍寬等特點，在抗生素分析中應(yīng)用最為廣泛。例如高立紅等［19］使用電噴霧離子化正離子（ESI＋）掃描MRM 模式可在33 min內(nèi)對3類22種抗生素進行分析；Zhang等［20］使用三重四極桿質(zhì)譜可在MRM 模式下30 min內(nèi)完成4類13種抗生素的同時分析；楊常青等［21］采用電噴霧正負離子切換（ESI＋／ESI-）MRM 模式可在10 min內(nèi)分析4類16種抗生素。然而，已報道的這些研究工作一般分析抗生素的類別較少，或者相對耗時較長，因此，對多類別多種抗生素快速準確分析方法的開發(fā)就顯得格外重要。本研究采用SPE-HPLC-MS／MS技術(shù)，建立了水中6類23種抗生素的同時定量分析方法，包括大環(huán)內(nèi)酯類（macrolides）、磺胺類（sulfonamides）、青 霉 素 類（penicillins）、氯 霉 素 類（chloramphenicols）、氟喹諾酮類（fluoroquinolones）和利福平（rifampicin）等，可在30 min內(nèi)完成全部目標抗生素分析，并成功應(yīng)用于5個海水養(yǎng)殖池水中目標抗生素的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

固相萃取儀（Auto Trace 280，美國Thermo公司）、氮吹儀（HGC-12，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）、高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC1100-6410B，美國Agilent公司）。

標準品：羅紅霉素（roxithromycin）、磺胺氯噠嗪（sulfachloropyridazine）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxypyrimidine）、磺胺甲基異惡唑（sulfamethoxazole）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、甲氧芐氨嘧啶（trimethoprim）、阿莫西林（amoxicillin）、青霉素G（penicillin G）、氯霉素（chloramphenicol）、氟 甲 砜 霉 素（florfenicol）、甲 砜 霉 素（thiamphenicol）、左氧氟沙星（ofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、恩諾沙星（enrofloxacin）、依諾沙星（enoxacin）、利福平、萬古霉素（vancomycin）和氘代磺胺甲惡唑（sulfamethoxazole-d4，100 ng／μL，溶劑為乙腈）均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；阿奇霉素（azithromycin）購自英國Fluorochem 公司；克拉霉素（clarithromycin）購自上海TCI公司。純度均高于98%，滿足定量分析需要。

甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純）購自美國Sigma公司，甲酸（分析純）購于天津市科密歐化學試劑有限公司，甲酸銨（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，超純水（18.2 MΩ·cm，25 ℃）由Heal Force超純水系統(tǒng)（上海力康公司）提供。

標準溶液的配制：準確稱取標準品0.010 0 g，用甲醇制成質(zhì)量濃度為1 g／L 的標準儲備液，保存于-20 ℃冰箱中。使用時用初始流動相稀釋。

1.2 樣品采集

在2014年6月，采集了東營海水養(yǎng)殖區(qū)5個海水養(yǎng)殖池水樣。養(yǎng)殖池水深2 m 以內(nèi)，所采集樣品均為表層水。每個養(yǎng)殖池中一次性采集水樣4 L，置于棕色玻璃瓶中，在低溫條件下保存并運回實驗室，1周之內(nèi)完成所有水樣前處理過程。

1.3 儀器條件

色譜柱：Xterra C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Waters公司）；進樣量：5μL；柱溫：40 ℃；流動相：0.1%（v／v）甲酸-1 g／L甲酸銨水溶液（A），甲醇-乙腈（1∶1，v／v）（B）。梯度洗脫程序：起始5%B，保持3 min；在30 min內(nèi)線性變?yōu)?8%B。流速0.3 mL／min。

質(zhì)譜條件：ESI＋／ESI-切換；MRM 數(shù)據(jù)采集模式。每種抗生素的詳細質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 所分析的抗生素的質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 1 MS detection parameters of the analyzed antibiotics

1.4 樣品前處理方法

水樣經(jīng)0.45μm 玻璃纖維濾膜過濾，準確量取1 L，加入回收率替代物氘代磺胺甲惡唑50 ng，用鹽酸-水溶液（1∶1，v／v）調(diào)節(jié)pH 至2.5，在Oasis HLB SPE小柱（500 mg／6 mL）上進行富集。上樣前，SPE柱依次用20 mL甲醇、6 mL超純水和6 mL鹽酸溶液（pH2.5）活化平衡；上樣時流速設(shè)為10 mL／min；上樣后先用10 mL超純水淋洗萃取小柱，用氮氣吹掃5 min，最后用甲醇洗脫。洗脫液在40 ℃水浴中用氮氣吹至近干，用初始流動相（5%B）溶解殘渣，定容至1 mL，過0.22μm 水相濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

6類抗生素的質(zhì)譜行為不同，氯霉素類在ESI-模式下有較強響應(yīng)，在ESI＋下信號非常弱，而其他幾類抗生素正好相反。因此本方法中選擇正、負離子模式同時監(jiān)測，一次性對所有目標抗生素進行分析，減少了分析所用時間。

分別考察了Waters Xterra色譜柱和Agilent Zorbax Eclipse XDB C18液相色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.5μm）對抗生素的分離效果，結(jié)果顯示Xterra色譜柱效果更佳。對比甲醇、乙腈和不同比例甲醇-乙腈作流動相時抗生素的分離情況，結(jié)果表明甲醇可以改善峰形，而乙腈可以提高分離度，在甲醇-乙腈體積比為1∶1的條件下各物質(zhì)峰形、響應(yīng)值和分離度達到最佳狀態(tài)。由于液相色譜-質(zhì)譜分析中樣品溶劑組成也會影響分析物的保留時間和峰形，從而影響對目標化合物檢測的靈敏度。因此本研究考察了甲醇和初始流動相作為樣品溶劑對色譜分離的影響。甲醇作樣品溶劑時，經(jīng)過梯度洗脫，抗生素能夠完全分離，但響應(yīng)值偏低且色譜峰出現(xiàn)前伸現(xiàn)象（見圖1a），嚴重影響定量分析結(jié)果；而采用初始流動相（5%B）時，各物質(zhì)的響應(yīng)和峰形都得到很大改善（見圖1b）。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

親水親脂平衡（HLB）型固相萃取柱，對極性和非極性物質(zhì)都有很好的回收率和重復(fù)性，因此常被用于類似研究中。本實驗選擇了Oasis HLB SPE柱（500 mg／6 mL）作為萃取柱，優(yōu)化了上樣pH。溶液pH 可以影響抗生素在水中的存在形態(tài)、穩(wěn)定性和與萃取柱填料之間的相互作用，從而影響萃取效果。對比酸性、中性（未調(diào)節(jié)pH）和堿性條件下HLB 柱對目標抗生素的富集效果，發(fā)現(xiàn)大部分抗生素在酸性條件下的回收率最高（見圖2），因此確定上樣pH為2.5。

2.3 洗脫液的考察

取1 L超純水，調(diào)節(jié)其pH 至2.5，在其中添加抗生素混合標準工作液100μL，經(jīng)HLB 柱富集，淋洗吹干后用不同量的甲醇進行洗脫。結(jié)果顯示，以6 mL甲醇洗脫兩次，效果較好；繼續(xù)增加洗脫液量，洗脫效果增加不明顯，且會增加后續(xù)處理的工作量。因此，以12 mL 甲醇分兩次對萃取柱進行洗脫，既保證了各抗生素都能有較高的回收率，又減小了洗脫液體積，有效地縮短了整個分析時間。

2.4 回收率、重現(xiàn)性和精密度

在提取樣品前添加回收率指示物，以控制整個樣品前處理過程的回收率。同時進行方法空白和平行樣的測定，以進行質(zhì)量控制與質(zhì)量保證。

根據(jù)儀器對23種目標抗生素的響應(yīng)以及水樣中抗生素可能的濃度，以初始流動相為溶劑配制抗生素混合標準工作液，并稀釋成5個系列梯度濃度。經(jīng)分析獲得工作曲線，所有目標物的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.995（見表2）。采用王艷潔等［22］介紹的國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會（IUPAC）推薦方法測定并計算方法檢出限（MDL），除阿莫西林為8.5 ng／L，其他目標抗生素為0.1～2.9 ng／L。在低、中和高3個添加水平下考察方法回收率（n＝3）分別為47.3%～122.2%、53.9%～132.6%、58.6%～125.7%，相對標準偏差（RSD）分別為1.6%～18.8%、0.6%～14.5%、1.2%～13.8%（見表3），表明該方法具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖1 抗生素標準樣品的色譜圖Fig.1 HPLC-MS／MS chromatograms of the antibiotics standards

圖2 上樣pH 對回收率的影響Fig.2 Effect of sample pH on the recoveries of target compounds

表2 目標化合物的保留時間、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）和方法檢出限Table 2 Retention times，calibration equations，correlation coefficients（r2）and method detection limits（MDLs）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

表3 目標化合物的加標回收率及相對標準偏差（n＝3）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the target compounds（n＝3）

2.5 實際樣品的分析

使用所建立的方法對東營地區(qū)5個養(yǎng)殖海水樣品中的抗生素進行分析，水樣中共檢出6種抗生素，總質(zhì)量濃度在7.4～378.9 ng／L 之間，該結(jié)果與Zhang等［18］在萊州灣采集的水樣中檢測到的抗生素含量相當，且海參養(yǎng)殖池水中抗生素總濃度明顯高于對蝦池。如表4所示，大環(huán)內(nèi)酯類中羅紅霉素共檢出2次，平均質(zhì)量濃度為0.8 ng／L；磺胺類中磺胺甲惡唑在3個水樣中被檢出，平均質(zhì)量濃度為0.3 ng／L，而磺胺增效劑甲氧芐氨嘧啶檢出頻率為100%，檢出質(zhì)量濃度可達98.2 ng／L；氯霉素類中甲砜霉素和氟甲砜霉素被檢出，其中氟甲砜霉素檢出質(zhì)量濃度最高，達到261.0 ng／L；氟喹諾酮類中恩諾沙星被檢出1次，檢出質(zhì)量濃度為18.7 ng／L；利福平檢出1次，檢出質(zhì)量濃度為0.3 ng／L。同時對所檢出6種抗生素在高添加水平（參見表3）下的模擬海水（鹽度35.0‰）進行了加標試驗，回收率的結(jié)果分別為羅紅霉素74.5%、磺胺甲惡唑53.9%、甲氧芐胺嘧啶77.9%、氟苯尼考71.6%、恩諾沙星65.9%以及利福平64.1%。所檢出的抗生素基本涵蓋了所有目標種類，顯示出本方法對實際水體抗生素分析的實用性和有效性。

表4 養(yǎng)殖池水樣中抗生素的分析結(jié)果Table 4 Analytical results of antibiotics in mariculture water

3 結(jié)論

本研究采用SPE-HPLC-MS／MS技術(shù)建立了水中6類23種抗生素同時測定的分析方法，結(jié)果表明該方法具有較好的靈敏度和穩(wěn)定性。用該方法對東營某海水養(yǎng)殖區(qū)5個養(yǎng)殖池水樣進行了初步檢測，除青霉素類外各類抗生素均有檢出，證明該方法可用于實際水樣的分析。

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