許 旭

（上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海201418）

介紹了最近色譜研究的幾個(gè)值得注意的重要進(jìn)展，包括UPLC高壓下蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化、HPLC流動(dòng)相統(tǒng)一pH 標(biāo)尺的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用、超細(xì)粒徑UPLC 中的滑移流研究、多維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的LC-GC×GCMS／MS和毛細(xì)管離子色譜-CE-MS方法、非水硅膠固定相中產(chǎn)生甲硅醚的證據(jù)以及用于實(shí)時(shí)呼氣分析的新方法。

1 高壓下的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化與UPLC中壓力的影響

蛋白質(zhì)因?yàn)閴毫Ξa(chǎn)生去折疊現(xiàn)象，其保留會(huì)隨壓力的上升而增大。美國(guó)Merck實(shí)驗(yàn)室的Makarov等［1］在UPLC柱與檢測(cè)器之間加一個(gè)可調(diào)節(jié)的背壓閥，在選定的流速與穩(wěn)定條件下使用UPLC-MS，通過(guò)氫-氘交換研究了超高壓力對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（去折疊）的影響。作者使用重水在45 ℃下孵育2 h使蛋白質(zhì)樣品實(shí)現(xiàn)充分的氘交換，以普通水溶解的蛋白質(zhì)樣品作為對(duì)照，根據(jù)含重水流動(dòng)相和不含重水流動(dòng)相UPLC 等度分離的結(jié)果，加上MS檢測(cè)樣品相對(duì)分子質(zhì)量的差異（即氘交換的質(zhì)量差ΔH）來(lái)評(píng)價(jià)壓力對(duì)蛋白質(zhì)中易于發(fā)生氘交換的活潑氫數(shù)量。結(jié)果顯示，壓力對(duì)存在α-螺旋的胰島素、細(xì)胞色素C、肌紅蛋白樣品的影響明顯，其處于疏水內(nèi)區(qū)不易交換的氫的數(shù)量隨壓力增大而逐漸減少，而對(duì)不存在α-螺旋的血管舒緩激肽沒有變化。升高溫度到75 ℃可使胰島素和細(xì)胞色素C均完全去折疊失去疏水內(nèi)區(qū)而實(shí)現(xiàn)全部交換。實(shí)驗(yàn)中還觀察到從不同來(lái)源獲得的兩個(gè)牛胰島素批次之間蛋白質(zhì)折疊的微小差異。該文利用UPLC的壓力結(jié)合氘交換差異的質(zhì)譜檢測(cè)，使UPLC-MS成為研究蛋白質(zhì)折疊的方便工具，并可用于區(qū)分高級(jí)結(jié)構(gòu)差異的蛋白質(zhì)組分。McCalley［2］最 近 總 結(jié) 了UPLC 實(shí) 驗(yàn) 中 壓 力 和 摩擦熱對(duì)保留、選擇性、柱效影響的理論與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。通常壓力會(huì)增加樣品在反相HPLC 中的保留，而且隨著分子增大，這種增大的幅度會(huì)更大。

2 HPLC流動(dòng)相的統(tǒng)一pH 標(biāo)尺

如何比較HPLC中含有不同有機(jī)溶劑流動(dòng)相的pH一直是一個(gè)棘手的問(wèn)題，德國(guó)Krossing I實(shí)驗(yàn)室曾以105Pa（1 bar）氣相質(zhì)子絕對(duì)化學(xué)勢(shì)為基準(zhǔn)通過(guò)理論推算提出統(tǒng)一的絕對(duì)pH（pHabs）標(biāo)尺，理論上通過(guò)測(cè)定浸入兩溶液中pH電極的電位差可以直接比較兩溶液中溶劑化質(zhì)子的活度，但因?yàn)橐航与妱?shì)的測(cè)定誤差而難以用于實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中。最近，其合作者愛沙尼亞的Leito I實(shí)驗(yàn)室再次與其合作［3］，借助Izutsu K對(duì)液接電位復(fù)雜的三分量計(jì)算方法，將其引入實(shí)際實(shí)驗(yàn)并得到一些常用甲醇和乙腈體系流動(dòng)相的pHabs值（參比為氣相）或pHH2Oabs值（參比為水溶液），這些結(jié)果可用于直接比較不同有機(jī)相和緩沖液之類的流動(dòng)相的酸性。對(duì)于通常HPLC中的流動(dòng)相，根據(jù)流動(dòng)相中除去有機(jī)相后測(cè)定的pH（wwpH）與pHH2Oabs之間的單調(diào)變化的關(guān)系，可用內(nèi)插法通過(guò)測(cè)定wwpH得到其pHH2Oabs值。用pHH2Oabs還可能更好地描述流動(dòng)相中弱酸和弱堿的離解行為。該結(jié)果將對(duì)HPLC和非水CE中pH 影響的理論研究提供重要幫助。

3 滑移流（slip flow）現(xiàn)象緩解了超細(xì)粒徑UPLC柱壓并獲得更好的柱效

亞2μm UPLC及核-殼顆粒固定相的高速高效分離能力已被廣泛用于小分子分離分析。由于大分子擴(kuò)散系數(shù)小，傳質(zhì)阻力大，在蛋白質(zhì)分離方面仍有待改進(jìn)。由于“滑移流”的存在，使用更小的亞微米顆粒在蛋白質(zhì)分離方面可以獲得出乎意料的結(jié)果。美國(guó)普渡大學(xué)的Wirth M J實(shí)驗(yàn)室在亞微米與滑移流研究中取得了很多值得注意的結(jié)果。最近他們發(fā)表的“Feature”文章［4］詳細(xì)介紹了這方面的進(jìn)展。普通色譜區(qū)帶的拋物線流型源于流動(dòng)相在固定相邊界的零流速，但當(dāng)流動(dòng)相與固定相間的相互作用弱于流動(dòng)相分子之間的相互作用且孔徑較小時(shí)，在固定相界面會(huì)存在非零的“滑移流”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不但顯示柱壓因?yàn)檫@種滑移流的存在而降低，而且柱效也比預(yù)期好得多。他們使用0.47μm 反相硅膠填裝的毛細(xì)管LC分離熒光標(biāo)記牛血清白蛋白（BSA）組分最高獲得過(guò)0.015μm 的塔板高度。這使蛋白質(zhì)組分的分離度和檢測(cè)靈敏度都獲得了很大改善。去年他們［5］使用0.47μm C18鍵合固定相獲得10倍的滑移流，經(jīng)nano-ESI實(shí)現(xiàn)與質(zhì)譜聯(lián)用，在高效分離和高重復(fù)性的同時(shí)獲得了高柱容量。

4 多維高效色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法

對(duì)于復(fù)雜樣品的全分析，多維分離是有吸引力的研究方向。意大利Mondello L 實(shí)驗(yàn)室［6］最近發(fā)表了在線LC-GC×GC-MS／MS方法，這被他們看成是一種五維方法（將三重四極桿質(zhì)譜看成二維的質(zhì)譜分離）。他們以煤焦油的二氯甲烷溶液為樣品，先用LC分離（100 mm×3 mm×5μm 硅膠柱，以正己烷-二氯甲烷流動(dòng)相梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)），將樣品分為非芳香烴、不飽和化合物、含氧化合物3組，并除去相對(duì)分子質(zhì)量太大的成分。再以該實(shí)驗(yàn)室已有的配有特制雙側(cè)端口進(jìn)樣針的AOC-5000自動(dòng)進(jìn)樣器作為L(zhǎng)C與GC之間的接口，通過(guò)這個(gè)改進(jìn)的25μL進(jìn)樣針將LC餾分從檢測(cè)器出口轉(zhuǎn)移到GC×GC-MS／MS系統(tǒng)（由兩臺(tái)GC2010氣相色譜與一臺(tái)TQ8030三重四極桿質(zhì)譜組成）。其中第一臺(tái)GC配備具有程序升溫功能的進(jìn)樣器和SLB-5ms柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），通過(guò)一段空毛細(xì)管（1.5 m×0.18 mm），用環(huán)形低溫調(diào)制器每5 s以300 ℃持續(xù)300 ms的熱脈沖調(diào)制進(jìn)樣到第二臺(tái)GC 中的短GC柱（Supelcowax-10，1.0 m×0.10 mm×0.10 μm）中。結(jié)果MS譜圖中的干擾因LC 的分離而明顯減少，從C11到C28的直鏈、支鏈和環(huán)狀的非芳香烴都得到滿意的識(shí)別，大多數(shù)含氧和不飽和化合物的質(zhì)譜譜圖相似度可以達(dá)到90%以上。利用100 ppb含硫標(biāo)樣的質(zhì)譜圖，通過(guò)MRM 檢測(cè)，分類識(shí)別了煤焦油中的大量含硫化合物。

對(duì)于復(fù)雜離子化合物樣品的多維分離，最近德國(guó)的Matysik F-M 小組［7］建立了用于離子分離的毛細(xì)管IC-CE-MS 聯(lián)用方法。毛細(xì)管離子色譜使用ICS-5000離子色譜儀（配有電導(dǎo)檢測(cè)器），以Dionex Ion-Swift MAX-200毛細(xì)管離子色譜柱（0.25 mm×250 mm）和40 mmol／L的KOH 水溶液流動(dòng)相（流速5μL／min）分離核苷酸和環(huán)核苷酸6種混合陰離子。離子色譜流出液連續(xù)流過(guò)一根轉(zhuǎn)移毛細(xì)管（內(nèi)徑75 μm，長(zhǎng)60 cm），使用該實(shí)驗(yàn)室已有的批式進(jìn)樣接口改進(jìn)后作為調(diào)制器，通過(guò)上下移動(dòng)轉(zhuǎn)移毛細(xì)管口，在上部30～50μm 處對(duì)準(zhǔn)分離毛細(xì)管（內(nèi)徑25μm，長(zhǎng)20.5 cm）的進(jìn)樣口，實(shí)現(xiàn)連續(xù)的第二維在線毛細(xì)管電泳 進(jìn) 樣（選 擇 每 間 隔15 s 進(jìn) 樣2 s）。以25 mmol／L的醋酸銨緩沖液（用氨水調(diào)到pH9.15）為毛細(xì)管電泳分離緩沖液，在22.5 kV 下電泳分離。以同軸鞘流電噴霧接口與micrOTOF-MS質(zhì)譜在線連接檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這些離子的IC-CE-MS完全分離和檢測(cè)。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，單用其中的一種分離條件沒有分開這些組分。由于離子色譜有柱后抑制器，其流出液的電導(dǎo)很低，他們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)毛細(xì)管電泳中存在區(qū)帶堆積效應(yīng)。

5 超臨界流體色譜中存在的甲硅醚

美國(guó)Waters公司的Fairchild等［8］以3-苯甲酰吡啶和黃酮（flavone）為樣品，用耐堿的雜化硅膠柱（BEH）在超臨界流體色譜（SFC）標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件（流動(dòng)相為CO2-甲醇（90∶10），柱溫40 ℃，背壓調(diào)節(jié)器壓力2 175 psi）下分不開兩組分，但在柱中存在甲醇（且沒有水）的情況下兩峰會(huì)隨著色譜柱放置時(shí)間延長(zhǎng)逐漸分開。固體NMR 顯示固定相表面存在鍵合的甲氧基，證實(shí)柱中的硅醇基逐漸轉(zhuǎn)換成甲硅醚。而使用含水流動(dòng)相沖洗可以將其較快地還原為硅醇狀態(tài)。0.1%的N，N-二甲基丁胺可以雙向催化這個(gè)可逆反應(yīng)。異丙醇也存在類似的反應(yīng)但速度很慢。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SFC 中保留時(shí)間和選擇性隨時(shí)間而變化的一個(gè)主要原因是甲硅醚的形成。甲硅醚由固定相表面的硅醇基與溶劑中的醇反應(yīng)產(chǎn)生。在SFC中，由于固定相表面形成甲硅醚，降低了親水性，可觀察到保留和選擇性的改變。甲硅醚的形成存在可逆平衡，在水中可以水解而再生。甲硅醚可能會(huì)出現(xiàn)在包括HPLC柱的任何含硅醇基的色譜填料中，但流動(dòng)相中含有5%的水就會(huì)顯著減弱甲硅醚的產(chǎn)生。色譜柱的儲(chǔ)存條件對(duì)甲硅醚的形成也有很大影響。

6 實(shí)時(shí)呼氣分析

近年來(lái)，實(shí)時(shí)呼氣分析作為一種非侵入性的方法已用于疾病診斷及呼出氣分子指紋譜分析。最常用的呼氣分析技術(shù)是GC-MS，但它難以用于實(shí)時(shí)樣品分析和非揮發(fā)成分的分析。德國(guó)Zimmermann R實(shí)驗(yàn)室［9］發(fā)展了一種實(shí)時(shí)快速檢測(cè)呼出氣中氣體有機(jī)物的直接MS分析方法。他們使用商品化的針阱式采樣器（needle trap device，NTD）采集呼出氣，與熱脫附光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（TD-PI-TOFMS）結(jié)合。質(zhì)譜儀經(jīng)去活石英毛細(xì)管連接到一個(gè)氣相色譜進(jìn)樣器。收集在NTD 中的分析物在進(jìn)樣器中熱解吸（TD）并轉(zhuǎn)移到PI-TOFMS 分析。整個(gè)TD-PITOFMS過(guò)程只需10 s。用單光子離子化（SPI）離子源在呼氣中可以檢測(cè)到丙酮、乙醛、異戊二烯、半胱胺等較小的有機(jī)物，而共振增強(qiáng)多光子離子源（REMPI）可以識(shí)別芳香族物質(zhì)酚和吲哚。吸煙者呼氣中的幾種外源性物質(zhì)如苯、甲苯、苯乙烯、乙基苯也可以被檢測(cè)到。該方法還用于分析麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（豬）呼出氣體中的麻醉劑丙泊酚。也可以將去活毛細(xì)管換成毛細(xì)管氣相色譜柱，在失去速度優(yōu)勢(shì)的情況下獲得NTD-TD-GC-PI-TOFMS更好的選擇性和準(zhǔn)確度。

瑞士蘇黎世聯(lián)邦高等工學(xué)院的Zenobi R 小組［10］則用反相UPLC與高分辨線性離子阱（LTQ）-軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用分析自制低溫冷阱收集的健康受試者呼出氣冷凝液，通過(guò)保留時(shí)間、串聯(lián)質(zhì)譜的裂解關(guān)系以及與標(biāo)樣的比較，從中鑒別出3類作為脂質(zhì)過(guò)氧化重要標(biāo)記物的中低揮發(fā)性醛類化合物。然后，單獨(dú)使用同一質(zhì)譜，配備低流量二次電噴霧離子源（LF-SESI），使呼氣通過(guò)加熱管直接進(jìn)入MS，實(shí)現(xiàn)了更適于臨床診斷的在線實(shí)時(shí)分析，部分組分還得到了二級(jí)MS譜圖。

［1］ Makarov A A，Schafer W A，Helmy R.Anal Chem，2015，87（4）：2396

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［6］ Zoccali M，Tranchida P Q，Mondello L.Anal Chem，2015，87（3）：1911

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［9］ Kleeblatt J，Schubert J K，Zimmermann R，et al.Anal Chem，2015，87（3）：1773

［10］ García-Gómez D，Sinues P M，Barrios-Collado C，et al.Anal Chem，2015，87（5）：3087