孫小杰，宋佳，尹華濤

(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210008；2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210028；3.國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心,北京 100029)

食品添加劑喹啉黃作為人工合成食用色素，色澤鮮艷、價(jià)格低廉，故為食品生產(chǎn)廠家廣泛使用。喹啉黃為水溶性偶氮類合成色素，在英國常用于冰糕、水果、蛋糕、巧克力、面包、奶酪醬、軟飲料等食品的著色。由于該色素可能導(dǎo)致兒童多動癥，日本、美國及挪威禁用于食品，而我國僅允許在配制酒中添加，且最大使用量為0.1 g／L［1］，但我國食品中喹啉黃檢測的方法標(biāo)準(zhǔn)一直未能及時(shí)跟上，造成了喹啉黃檢測項(xiàng)目的缺失。

目前測定喹啉黃的文獻(xiàn)報(bào)道較少，阮麗萍等和楊富春等采用液相色譜法對食品中喹啉黃含量進(jìn)行了測定［2-3］，由于色譜條件的不同，喹啉黃部分組分由于未得到有效分離而造成色譜峰個(gè)數(shù)存在差異［4-5］，對于喹啉黃組成的探討也未見報(bào)道。已有報(bào)道的文獻(xiàn)中喹啉黃的定量都是以峰面積總和作為定量的基礎(chǔ)，而液相色譜易受到其它色素的干擾，無法滿足檢測的定性確證要求［6-7］。近年來，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LS-MS／MS)在著色劑分析領(lǐng)域的運(yùn)用發(fā)展迅速，彌補(bǔ)了液相色譜定性不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。馬曉燕等和伊熊海等對于喹啉黃是以喹啉黃二鈉鹽來定量［8-9］，F(xiàn)eng Feng等研究是以喹啉黃作為一鈉鹽來定量［10］，而單獨(dú)測定喹啉黃一鈉鹽、二鈉鹽并不能準(zhǔn)確反映喹啉黃的實(shí)際含量。喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品為喹啉黃混合物，因此測定出喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是準(zhǔn)確檢測喹啉黃的前提。筆者利用液相色譜對喹啉黃各組分進(jìn)行分離，通過質(zhì)譜法對各組分進(jìn)行定性，用峰面積歸一化法得出喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為準(zhǔn)確檢測食品中喹啉黃的含量提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配有二極管陣列檢測器(DAD)，美國Agilent公司；

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1260 HPLC-6460 QQQ型，配有電噴霧離子源，美國Agilent公司；

電子天平：XS205型，瑞士Metler Toledo公司；

甲醇：色譜純，美國ROE公司；

乙酸銨：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；

喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度為97.5%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

食品添加劑喹啉黃：印度VIDHI公司；

甲醇：色譜純，美國ROE公司；

實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)(0.22 μm過濾膜)過濾的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，室溫保存?zhèn)溆?。用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要再將其配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：A為0.01 mol／L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min，20% B，1.0～20.0 min，20%～90% B，20.0～22.0 min，90%～20.0% B，22.0～25.0 min，保持20% B；流量：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測波長：415 nm。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：-4 000 V；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：5 L／min；霧化氣壓力：310 kPa(45 psi)；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：11 L／min；定性離子對、定量離子對、碎裂電壓、碰撞能量見表1。

表1 喹啉黃的定性離子對、定量離子對、碎裂電壓、碰撞能量

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

稱取100.0 mg食品添加劑喹啉黃樣品至100 mL容量瓶中，用純水溶解并定容。用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要再將其稀釋后過0.45μm水相濾膜，濾液上機(jī)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 喹啉黃各組分的分離

2.1.1 HPLC條件的選擇及優(yōu)化

由于喹啉黃結(jié)構(gòu)中含有磺酸根基團(tuán)，乙酸銨溶液的存在可以促進(jìn)目標(biāo)物的保留和分離，改善峰形，加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的增加，流動相的極性逐漸減小，洗脫能力逐漸增強(qiáng)，兼顧到合適的保留時(shí)間和良好的色譜峰形，最終選擇甲醇初始比例為20%，流動相采用梯度洗脫。喹啉黃4個(gè)組分的色譜峰的最大吸收波長都在415 nm左右(見圖1)，且實(shí)際檢測過程中無基質(zhì)干擾，因此選擇415 nm作為檢測波長。

圖1 喹啉黃的光譜圖

2.1.2 喹啉黃的HPLC分析

分別以10 μg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液和食品添加劑喹啉黃溶液為研究對象，在1.3.1條件下對喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品和食品添加劑喹啉黃進(jìn)行分析，色譜圖分別見圖2及圖3。在該色譜條件下，喹啉黃4個(gè)組分完全分離，證明流動相的選擇合理、分離效果好。結(jié)果表明：喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品和食品添加劑喹啉黃的色譜圖都存在4個(gè)主要的色譜峰，由于合成工藝的不同，由峰面積比較可以看出，喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品主要成分為后兩處峰的組分，而食品添加劑喹啉黃主要成分為前兩處峰的組分。

圖2 喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖3 食品添加劑喹啉黃的HPLC色譜圖

2.2 喹啉黃各組分的定性分析

2.2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

首先采用LC-MS的SCAN模式，掃面范圍為50～500 m／z時(shí)，得到喹啉黃的特征母離子，然后分別優(yōu)化其母離子的出口毛細(xì)管處電壓，確定其響應(yīng)最大的出口毛細(xì)管處電壓，然后分別對其母離子進(jìn)行二次選擇性電離，通過優(yōu)化碰撞能量，選取適合檢測分析的子離子。

2.2.2 喹啉黃各組分的質(zhì)譜分析

以10 μg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，應(yīng)用LC-MS／MS對4個(gè)峰進(jìn)行驗(yàn)證，MRM色譜圖見圖4。

圖4 喹啉黃的MRM色譜圖

由圖4可知，MRM色譜圖中同樣出現(xiàn)4個(gè)色譜峰，喹啉黃一鈉鹽相對分子質(zhì)量為375，含一個(gè)SO3Na基團(tuán)，m／z 352.0為[M(375)-Na]模式；喹啉黃二鈉鹽相對分子質(zhì)量為477，含兩個(gè)SO3Na基團(tuán)，m／z 432.0為[M(477)-2Na+1H]模式。因此前兩處色譜峰為喹啉黃二鈉鹽的色譜峰，后兩處色譜峰為喹啉黃一鈉鹽的色譜峰。按保留時(shí)間的前后分別定義為QYNa2Ⅰ，QYNa2Ⅱ，QYNaⅠ，QYNaⅡ。

2.3 喹啉黃各組分的定量分析

2.3.1 HPLC法測定喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

以1.0 mg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，用峰面積歸一化法對4組峰積分得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并在相同情況下平行測定6次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 喹啉黃各組分的含量和精密度試驗(yàn) %

由表2可見，喹啉黃4個(gè)組分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.09%，1.58%，1.25%，0.90%。說明方法的精密度較高，重復(fù)性較好。

2.3.2 線性方程

喹啉黃的質(zhì)量濃度x在5.0～100.0 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 9)，以喹啉黃4種組分測量信噪比為S／N=3時(shí)的進(jìn)樣濃度定義為檢出限，結(jié)果列于表3。

表3 喹啉黃各組分的線性關(guān)系

2.3.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

通過向10.0 μg／mL的喹啉黃試樣溶液中添 加 低(5.0 μg／mL)、中(25.0 μg／mL)、高(50.0 μg／mL)3個(gè)濃度水平的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度樣品平行測定6次，測定結(jié)果見表4。

表4 方法回收試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，喹啉黃4個(gè)組分的回收率在98.2%～99.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%～1.14%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜檢測喹啉黃各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，利用液相色譜法對喹啉黃各組分進(jìn)行了分離并進(jìn)行含量測定，通過液質(zhì)聯(lián)用法對各組分進(jìn)行了定性研究。研究發(fā)現(xiàn)喹啉黃主要成分為喹啉黃一鈉鹽和二鈉鹽，同時(shí)各有兩種同分異構(gòu)體，利用峰面積歸一化法得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；谑称坊|(zhì)復(fù)雜，對于不同食品中喹啉黃檢測的前處理方法還需要做進(jìn)一步研究。

［1］GB 2760-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

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