蘭雪梅，譚 歡，鐘白玉，馮 林，楊希川

雄激素性脫發(fā)（androgenetic alopecia）是一種常見的脫發(fā)性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要涉及脫發(fā)區(qū)雄激素受體（AR）表達(dá)增加、AR 活性增加、Ⅱ型5α 還原酶活性增加、下游細(xì)胞因子分泌異常等[1]。除毛囊干細(xì)胞[2]，毛乳頭細(xì)胞（DPC）對(duì)毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生及周期性生長(zhǎng)調(diào)控具有重要的意義。體外培養(yǎng)人DPC，傳代至3 代以后DPC 表達(dá)AR 的能力逐漸減弱[3]， DPC 作為雄激素性脫發(fā)的體外研究模型的可靠性有待進(jìn)一步的提高。本研究通過構(gòu)建AR 過表達(dá)腺病毒載體，并且轉(zhuǎn)染DPC，為體外研究雄激素性脫發(fā)提供更理想的研究模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于整形科手術(shù)且患有男性雄激素性脫發(fā)患者的頂部頭皮。

1.1.2 主要試劑 AR 基因質(zhì)粒（重慶金麥生物技術(shù)有限公司），膠原酶（Sigma 公司），分離酶（Sigma公司），AR 抗體為兔抗人單克隆抗體（Abcam 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天公司），胎牛血清（Gibco 公司）。

1.2 方法

1.2.1 AR基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、腺病毒的包裝及擴(kuò)增 BglⅡ、XbaⅠ雙酶切穿梭載體Adtrack-CMV及AR目的基因，酶切質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH10B細(xì)胞。篩選出具有抗卡那霉素的質(zhì)粒，命名為Adtrack-AR。將鑒定正確的質(zhì)粒用PmeⅠ線性化， pAdeasy和線性化的Adtrack-AR共電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)菌BJ5183中，篩選出卡那霉素+氨芐青霉素+鏈霉素抗性的質(zhì)粒，最終獲得pAdeasy-Adtrack-AR酶切產(chǎn)物。將回收質(zhì)粒轉(zhuǎn)染密度為70%～80%的293T細(xì)胞，6～8 h后換含1%FBS的培養(yǎng)基，每日觀察熒光的變化，待熒光增多，2/3細(xì)胞浮起時(shí)離心收集病毒液，將收集的病毒液加入密度為80%左右的293T細(xì)胞中，最后將收集的病毒液-80 ℃反復(fù)凍融3～5次，使細(xì)胞成分破裂，病毒釋放出來，上清即為病毒原液。

1.2.2 二步酶法分離及培養(yǎng) 頭皮標(biāo)本用PBS 反復(fù)沖洗并剃凈毛發(fā)，以無菌含1%青霉素-鏈霉素的D-hanks 液漂洗3 ～5 次，每次5 min。分離皮下筋膜，用無菌手術(shù)剪剪成0.3 ～0.5 cm 寬、3 ～4 cm 長(zhǎng)的皮條，棄去真皮部分，將皮下脂肪保留。加入0.5%的分離酶4 ℃浸泡過夜，再放入37 ℃恒溫冰箱消化30 min，D-hanks 液清洗及擠出毛干，再將脂肪條剪成漿糊狀，加入0.2%Ⅳ型膠原酶37 ℃消化4 ～6 h，當(dāng)出現(xiàn)梨形的毛乳頭時(shí)即可終止消化。最后離心獲得毛乳頭，接種于含1%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。3 ～6 代毛乳頭細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)AR的表達(dá) 將DPC接種于6孔板蓋玻片上，制作細(xì)胞AR重組腺病毒轉(zhuǎn)染DPC的細(xì)胞爬片，加入AR抗體4 ℃過夜，加入FITC標(biāo)記的二抗，孵育，封片，最后共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 收集AR 重組腺病毒組、空載體腺病毒組、對(duì)照組（未添加病毒）的DPC，加入蛋白裂解液，收集蛋白，AR 單克隆抗體孵育過夜，二抗孵育。

1.2.5 CCK-8法 AR重組腺病毒組、空載體腺病毒組、對(duì)照組分別于轉(zhuǎn)染后48 h加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 ～4 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度（A）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

AR 蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白灰度值得到A 值，即AR蛋白的相對(duì)含量，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組均值比較用單因素方差分析，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pAdeasy-Adtrack-AR腺病毒載體的鑒定

質(zhì)粒由重慶金麥生物技術(shù)有限公司測(cè)序，證實(shí)pAdeasy-Adtrack-AR 腺病毒載體的序列正確，說明AR 基因的重組腺病毒載體構(gòu)建正確。

2.2 第3、6、9代毛乳頭細(xì)胞AR檢測(cè)

同一瓶原代DPC 傳代至3、6、9 代，然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。3 代DPC 的AR A 值（0.466±0.131）明顯高于6 代（0.209±0.051）及9 代（0.334±0.11）DPC 的AR A 值，且3 代AR A 值與6 代AR A 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.025），表明在傳代過程中AR蛋白的表達(dá)量不穩(wěn)定（圖1）。

2.3 腺病毒轉(zhuǎn)染后免疫熒光檢測(cè)

重組腺病毒組于轉(zhuǎn)染后48 h 在共聚焦顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上（圖2）。

2.4 腺病毒轉(zhuǎn)染后蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

圖1 第3、6、9代毛乳頭細(xì)胞AR表達(dá)電泳圖

圖2 AR重組腺病毒組轉(zhuǎn)染48 h后免疫熒光圖（×200）

腺病毒轉(zhuǎn)染DPC 后24、48、72 h 分別檢測(cè)其AR 的表達(dá)量。重組腺病毒轉(zhuǎn)染后48 h 時(shí)，AR 蛋白的表達(dá)量明顯升高，轉(zhuǎn)染72 h 時(shí)AR 蛋白的表達(dá)量較48 h 時(shí)明顯降低，轉(zhuǎn)染后48 h 組與空載體組、空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染后24 h 組、轉(zhuǎn)染后72 h 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006），說明轉(zhuǎn)染后48 h AR 表達(dá)最高（表1，圖3）。

表1 AR重組腺病毒轉(zhuǎn)染后蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)AR的表達(dá)

圖3 各組DPC轉(zhuǎn)染后AR的表達(dá)電泳圖

2.5 腺病毒轉(zhuǎn)染后CCK-8法檢測(cè)

腺病毒轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，采用CCK-8 法檢測(cè)其對(duì)DPC 增生的影響。AR 重組腺病毒組、空載腺病毒組、對(duì)照組DPC 細(xì)胞增生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 AR重組腺病毒轉(zhuǎn)染后CCK-8檢測(cè)結(jié)果

3 討論

雄激素性脫發(fā)的發(fā)病依賴于多種因素，包括遺傳、雄激素量、雄激素受體、Ⅱ型5α 還原酶等[4]。研究發(fā)現(xiàn)雄激素性脫發(fā)的發(fā)病與血液循環(huán)中的雄激素量無關(guān)，而與局部的雄激素量有關(guān)。毛囊是雄激素的作用位點(diǎn)，同時(shí)它作為一個(gè)外周器官可通過自分泌或旁分泌的形式合成雄激素。在頭皮頂部雄激素由Ⅱ型5α 還原酶轉(zhuǎn)變?yōu)殡p氫睪酮，后者與雄激素受體結(jié)合導(dǎo)致了雄激素性脫發(fā)的發(fā)生。雄激素性脫發(fā)患者頭頂部Ⅱ型5α 還原酶的含量高于健康志愿者[5]，由于頭皮局部Ⅱ型5α 還原酶的差異導(dǎo)致了頭皮枕部及頂部毛發(fā)生長(zhǎng)存在差異。有研究者發(fā)現(xiàn)雄激素性脫發(fā)患者頭頂部DPC 內(nèi)AR 的量要明顯高于正常人頭頂部[6]。在雄激素性脫發(fā)發(fā)病機(jī)制中，AR 和Ⅱ型5α 還原酶均作為發(fā)病的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)[7]。

AR 是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，它屬于類固醇/核受體超家族[8]。AR 由熱休克蛋白70、90、56 組成，當(dāng)雄激素與AR 相結(jié)合后熱休克蛋白分解，從而暴露了核轉(zhuǎn)錄信號(hào)，使雄激素受體配體復(fù)合物運(yùn)輸至核內(nèi)，進(jìn)而與雄激素調(diào)控基因相結(jié)合[9]。在此過程中刺激或抑制信使蛋白或者AR，均可以刺激或者抑制毛囊的生長(zhǎng)[10]。

本次實(shí)驗(yàn)觀察到，第6 代DPC 內(nèi)的AR 明顯降低，從而影響了體外研究雄激素性脫發(fā)的發(fā)病機(jī)制的可靠性。并且既往研究證實(shí)了DPC 傳代至第3 代以后AR 的表達(dá)量會(huì)逐漸降低甚至消失[11]。與文獻(xiàn)報(bào)道不同的是，本實(shí)驗(yàn)同一瓶細(xì)胞傳至第9 代時(shí)，AR 的表達(dá)量較第6 代DPC 的AR 量升高，但兩者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是由于AR 的合成還存在著一定的代償機(jī)制。

蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，毛乳頭細(xì)胞轉(zhuǎn)染AR重組腺病毒載體后，AR 蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組及空載體組會(huì)升高，尤其在轉(zhuǎn)染后48 h，充分說明了AR重組腺病毒載體構(gòu)建成功。當(dāng)腺病毒轉(zhuǎn)染毛乳頭細(xì)胞72 h 后，AR 蛋白表達(dá)下降，這可能是由于腺病毒不整合至毛乳頭細(xì)胞的基因組，病毒基因組在宿主細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行擴(kuò)增，AR 基因瞬時(shí)表達(dá)，因而AR 的表達(dá)最終會(huì)因?yàn)榧?xì)胞的增生分裂而稀釋；也可能是由于有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制參與AR 基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。

在既往研究中，當(dāng)干擾前列腺癌細(xì)胞中AR 的表達(dá)時(shí)，前列腺癌細(xì)胞的增生率會(huì)下降[12]。而在本次實(shí)驗(yàn)中，AR 重組腺病毒載體未抑制毛乳頭細(xì)胞的生長(zhǎng)，說明轉(zhuǎn)染并未明顯影響DPC 的正常增生功能，且更能接近毛乳頭細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。

在以往的研究中，研究者通過AR 質(zhì)粒型表達(dá)載體來彌補(bǔ)毛乳頭細(xì)胞AR 基因衰減這一難題，但是前者的轉(zhuǎn)染效率低[11,13]，且轉(zhuǎn)染困難。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建AR 重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染效率高，在一定程度上為研究雄激素性脫發(fā)提供了更理想的體外研究模型。但是本研究也存在一定的局限性：腺病毒表達(dá)系統(tǒng)僅瞬間表達(dá)，AR 基因不能穩(wěn)定表達(dá)，不能完全解決AR 蛋白隨著傳代而衰減的問題，可以通過重復(fù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染腺病毒或者通過構(gòu)建AR 慢病毒載體來進(jìn)行下一步的研究；并且本次實(shí)驗(yàn)著重以AR 為研究點(diǎn)，而未全面涉及到雄激素性脫發(fā)發(fā)病的其他因素，AR 表達(dá)量增加是否會(huì)影響Ⅱ型5α 還原酶的表達(dá)，是否使下游信號(hào)通路發(fā)生轉(zhuǎn)變[14]，還有待今后進(jìn)一步的研究。

[1] Inui S, Itami S. Molecular basis of androgenetic alopecia: From androgen to paracrine mediators through dermal papilla [J]. J Dermatol Sci, 2011, 61(1):1-6.

[2] Leiros GJ, Attorresi AI, Balana ME. Hair follicle stem cell differentiation is inhibited through cross-talk between Wnt/β-catenin and androgen signalling in dermal papilla cells from patients with androgenetic alopeciaa [J]. Br J Dermatol, 2012, 166(5):1035-1042.

[3] Kwack MH, Sung YK, Chung EJ, et al. Dihydrotestosterone-inducible dickkopf 1 from balding dermal papilla cells causes apoptosis in follicular keratinocytes [J]. J Invest Dermatol, 2008, 128(2):262-269.

[4] Piraccini BM, Alessandrini A. Androgenetic alopecia [J]. G Ital Dermatol Venereol , 2014, 149(1):15-24.

[5] Bayne EK, Flanagan J, Einstein M, et al. Immunohistochemical localization of types 1 and 2 5alpha-reductase in human scalp [J]. Br J Dermatol, 199,141(3):481-491.

[6] Urysiak-Czubatka I, Kmie? ML, Broniarczyk-Dy a G. Assessment of the usefulness of dihydrotestosterone in the diagnostics of patients with androgenetic alopecia [J]. Postepy Dermatol Alergol, 2014, 31(4):207-215.

[7] 郭金竹, 李鄰峰. 雄激素性禿發(fā)治療進(jìn)展 [J]. 實(shí)用皮膚病學(xué)雜志, 2012, 5(6):347-350.

[8] Lavery DN, Villaronga MA, Walker MM, et al. Repression of androgen receptor activity by HEYL, a third member of the Hairy/Enhancer-of-split-related family of Notch effectors [J]. J Biol Chem, 2011, 286(20):17796-17808.

[9] Jehle K, Cato L, Neeb A, et al. Coregulator control of androgen receptor action by a novel nuclear preceptor-binding motif [J]. J Biol Chem, 2014, 289(13):8839-8851.

[10] Chang C, Yeh S, Lee SO, et al. Androgen receptor(AR) pathophysiological roles in androgen-related diseases in skin, bone/muscle, metabolic syndrome and neuron/immune systems: lessons learned from mice lacking AR in specific cells [J]. Nucl Recept Signal, 2013, 11:e001.

[11] Inui S, Fukuzato Y, Nakajima T, et al. Identification of androgeninducible TGF-beta1 derived from dermal papilla cells as a key mediator in androgenetic alopecia [J]. J Investig Dermatol Symp Proc, 2003, 8(1):69-71.

[12] 顏艷靈, 鐘雪云, 鐘振宇, 等. 利用RNA干擾技術(shù)研究雄激素受體在人前列腺癌細(xì)胞增殖中的作用 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2004, 20(4):580-583.

[13] Itami S, Inui S. Role of androgen in mesenchymal epithelial interactions in human hair follicle [J]. J Investig Dermatol Symp Proc, 2005, 10(3):209-211.

[14] Yang YC, Fu HC, Wu CY, et al. Androgen receptor accelerates premature senescence of human dermal papilla cells in association with DNA damage [J]. PloS One, 2013, 8(11):e79434.