屠宰場(chǎng)疑似牛結(jié)核病料的細(xì)菌分離和PCR鑒定

古努爾·吐?tīng)栠d1，努爾巴哈提1，古麗拜克熱木·斯拉吾丁2，郭慧玲1，呼西旦·阿巴拜克力1*
（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊830000；
2.新疆察布查爾縣獸醫(yī)站，新疆 察布查爾835300）

為了解屠宰場(chǎng)疑似牛結(jié)核組織病料中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）的感染狀況，在烏魯木齊市屠宰場(chǎng)采集包括肺、淋巴結(jié)、乳房在內(nèi)的16份疑似牛結(jié)核可疑結(jié)節(jié),分別接種于培養(yǎng)基進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）的分離，獲得的5株臨床分離菌用MTC多重PCR鑒定，兩株為MTC菌株，兩株為非結(jié)核分枝桿菌，另一株未擴(kuò)增出可用于鑒定的特異性片段。該結(jié)果表明屠宰場(chǎng)所采病料中存在結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的感染。

牛結(jié)核；MTC；多重PCR

修回日期：2015-02-11

牛結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTC）中的牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人畜共患病[1]。MTC包括結(jié)核桿菌、牛分支桿菌、非洲分枝桿菌、微小分枝桿菌、卡氏分枝桿菌和卡介苗，這些菌株都可感染牛并出現(xiàn)結(jié)核結(jié)節(jié)樣病變。該病主要通過(guò)患病呼吸道分泌物和咳嗽所產(chǎn)生的氣溶膠感染；人則主要通過(guò)食用未經(jīng)高溫處理病牛的奶肉感染[2,3]。屠宰場(chǎng)的檢疫是防治感染牛肉進(jìn)入市場(chǎng)的最后環(huán)節(jié)[4]。在屠宰場(chǎng)，檢疫人員主要是通過(guò)肉眼觀察屠宰后牛的相關(guān)組織及其淋巴結(jié)的變化，初步確定是否有MTC感染[5,6]，但最后的確診還需要進(jìn)行MTC的分離和鑒定。該項(xiàng)工作不僅耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)操作繁瑣，而且常出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及結(jié)核桿菌特異性核苷酸序列分析所取得的成果，通過(guò)基因擴(kuò)增進(jìn)行MTC鑒定已成為該類(lèi)菌鑒定最可靠的技術(shù)方法之一[7,8]。建立的利用該方法能快速、特異性的鑒別出結(jié)核病牛組織中MTC的種屬并對(duì)其作出準(zhǔn)確診斷。本實(shí)驗(yàn)用Steve Wilton等建立的16s rRNA多重PCR方法[7]，對(duì)屠宰場(chǎng)采集的可疑結(jié)節(jié)病料中分離到的菌株進(jìn)行了鑒定，簡(jiǎn)便、快速確定了MTC的感染。

1 材料與方法

1.1試劑

2×Taq PCR Master Mix購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司；100bp DNA Marker、EB(溴化乙錠)購(gòu)自鼎國(guó)公司昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2 培養(yǎng)基

用于MTC分離的丙酮酸鈉培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)基（Lowenstein-Jensen）均由本實(shí)驗(yàn)室按標(biāo)準(zhǔn)配方制備。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參照Steve Wilton[7]等文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，由鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.4 病料來(lái)源

采自烏魯木齊市屠宰場(chǎng)宰后檢疫采集的疑似結(jié)核病變組織，該組織包括肺、淋巴結(jié)、乳房等。屠宰牛分別來(lái)自烏魯木齊米東區(qū)、昌吉、伊犁。

1.5 參考菌種

牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株M.bovis菌由北京解放軍309醫(yī)院提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.6疑似結(jié)核病料的采集

在屠宰場(chǎng)與當(dāng)?shù)貦z疫人員合作，共對(duì)屠宰后的800余頭牛進(jìn)行了肺、淋巴結(jié)、胸膜、支氣管、乳房等臟器的感官和觸摸檢查，采集有結(jié)節(jié)狀病變且堅(jiān)硬、無(wú)滑動(dòng)感的病變結(jié)節(jié)。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 乳房組織中的疑似結(jié)核結(jié)節(jié)

圖2 肺組織中的疑似結(jié)核結(jié)節(jié)

1.7病料中MTC的分離培養(yǎng)

分別從16份病變組織樣品結(jié)節(jié)內(nèi)吸出黃色痰性物，勻漿后加入4%的等量NaOH；室溫靜置20 min后，用2mol/L HCl調(diào)PH至7.2~7.4，4 000 rpm離心20 min，沉淀懸浮于生理鹽水，用移液器取0.2 mL接種至丙酮酸鈉培養(yǎng)基和甘油培養(yǎng)基（Lowenstein-Jensen），37℃培養(yǎng)4～8周，觀察結(jié)果。

1.8待檢菌株的處理

分別將分離菌株、牛分枝桿菌參考株加入含有TE緩沖液（pH8.0）試管中，置水浴鍋中煮沸10 min滅活并釋放DNA，4 000 rpm離心20 min，收集上清，用于PCR擴(kuò)增。

1.9多重PCR擴(kuò)增

分別以牛分枝桿菌參考株作為陽(yáng)性對(duì)照，H2O作為空白對(duì)照，對(duì)處理后的樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。PCR引物分別為Mycgen、TB1、Mycav和Mycint共4對(duì)；反應(yīng)體系為10 μL：其中樣品3 μL，4對(duì)引物的上下游引物各0.2 μL。反應(yīng)條件為94℃10 min，61℃2min，72℃3 min；1個(gè)循環(huán)后再以94℃1 min，61℃2 min，72℃3 min擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)；再以94℃10 min，61℃2 min，72℃3 min擴(kuò)增1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。

1.10擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果判定

引物MYCGEN擴(kuò)增出1030 bp片段為分枝桿菌，引物TB擴(kuò)增出372 bp片段為MTC（包括人分枝桿菌和牛分枝桿菌等）；MYCA引物擴(kuò)增出180bp片段為禽分枝桿菌，MYCINT引物擴(kuò)增出850 bp片斷為胞內(nèi)分枝桿菌。

2 結(jié)果與分析

2.1病料采集與細(xì)菌分離

共檢疫出16份疑似結(jié)核病變的結(jié)節(jié)組織，切開(kāi)結(jié)節(jié)可見(jiàn)有黃色痰性物。從16份病料中分離到疑似MTC 5株，其編號(hào)為SM1，SM2，SM3，SM4和SM5。

2.2多重PCR鑒定結(jié)果

從圖3的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖可見(jiàn)，第2、5泳道的臨床菌株SM2和SM5分別被引物MYCGEN擴(kuò)增出了1030 bp片段和被引物TB擴(kuò)增出了372 bp片段，兩對(duì)引物擴(kuò)增出的DNA帶型與第6泳道的參考菌株一致，即確定為MTC群；第1、3泳道的臨床菌株SM1和SM3僅被引物MYCGEN擴(kuò)增出1030 bp片段，表明為分枝桿菌；第4泳道的株菌SM4所有引物均未擴(kuò)增出DNA片段，表明該菌株為非MTC。

3 討論

牛結(jié)核是由MTC中牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性傳染病，以漸進(jìn)性消瘦、咳嗽、多種組織器官形成干酪樣壞死或鈣化結(jié)節(jié)為特征。我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。該病依據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化可做出初步診斷。確診則需進(jìn)一步做病原分離鑒定或免疫學(xué)診斷。屠宰場(chǎng)的檢疫則是防止該病及其畜產(chǎn)品擴(kuò)散、蔓延最后的關(guān)口[9]。我們?yōu)榱私馕覅^(qū)屠宰牛疑似結(jié)核結(jié)節(jié)中MTC的感染現(xiàn)狀，根據(jù)其特征性病理變化采集了相關(guān)的病料并進(jìn)行了病原學(xué)檢測(cè)，確診了我區(qū)部分地區(qū)屠宰牛有結(jié)核菌感染的情況。

MTC是分枝桿菌5個(gè)復(fù)合群之一，也是3大致病性復(fù)合分枝桿菌群（鳥(niǎo)胞內(nèi)和偶然分枝桿菌）成員之一[10]。PCR菌種鑒定法是用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的特異性引物對(duì)待檢菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)疑似結(jié)核結(jié)節(jié)中分離菌株選擇分枝桿菌16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，所采病料中除MTC菌株外，還有非MTC感染存在，同時(shí)也證明該方法可以區(qū)分病料中MTC和非MTC感染。

[1]Ameni G，Aseffa A，Sirak A，et al．Effect of skin testing and segregation on the prevalence of bovine tuberculosis and molecular typing of Mycobacterium bovis in Ethiopia[J]．The Veterinary Record，2007，161(4)：782－786．

[2]Ameni G，Amenu K，Tibbo M．Bovine tuberculosis：prevalence and risk fact or assessment in cattle and cattle owners in Wuchale—Jida District，Central Ethiopia[J]．Int J Appl Ras，2003．

[3]蘭德松．牛結(jié)核病及其風(fēng)險(xiǎn)分析[J]．中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011，27(9)：839-841．

[4]木旦古麗·艾山,吐送古麗·吐送尼牙孜.牛結(jié)核病在屠宰中的檢疫和處理[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，2007，24 （10）：31．

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[6]努爾古麗·艾買(mǎi)提，艾力麥麥提·麥麥提力.牛結(jié)核病的屠宰鑒定和處理[J]．新疆畜牧業(yè)，2007，（5）:33-35．

[7]Steve Wilton1, and Debby Cousins. Detection and Identification of Multiple Mycobacterial Pathogens by DNA Amplification in a Single Tube[J]．PCR Methods and Applications,1992，1(4)：1637-1650．

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[9]王華，孫成友，王淑娟，等．牛結(jié)核病的傳播特點(diǎn)和風(fēng)險(xiǎn)因素及防控[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13 （23）：4583-4586.

[10]王忠仁．牛結(jié)核病與人結(jié)核病的相互關(guān)系[J]．中國(guó)防澇雜志，2005，27（2）：123-125．

MTC；multiplex PCR

Mycobacterium Tuberculosis Isolation from Suspected Samples Collected in Slaughterhouse and the Identification by PCR

GULNUR·Tursun1，NURBAHTI1，GULBAHREM·Sirayiding2，GUO Hui-ling1，HUXIDAN·Ababekiri1
（1. Institute of Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China；
2. Veterinary Station of Qapuqal County，Qapuqal Xinjiang 835300，China）

To understand of the infection status on of mycobacterium tuberculosis complex（MTC）from suspected tissue of bovine tuberculosis in abattoir,16 suspected tissue samples including lung, lymph nodes, breast, were collected and the MTC were isolated. 5 strains obtained from the culture were identified by MTC multiple PCR. Result shows that 2 of them are MTC and other 2 non-MTC, another one has no specific sizes for identification. It also shows that MTC and non-MTC were existed in suspected samples collected in slaughterhouse.

bovine tuberculosis；

S851

A

1003－6377（2015）03－0039-04

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目“草食家畜促生長(zhǎng)、致病微生物和抗病基因的查驗(yàn)證及檢測(cè)方法的建立”（KY2014008）

古努爾·吐?tīng)栠d（1971-），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事牛結(jié)核病的預(yù)防研究。

E-mail :gulnural@126.com

呼西旦·阿巴拜克力，女，研究員，主要從事牛結(jié)核病的預(yù)防研究。

E-mail:1981014258@qq.com

2015-02-05，