張 憲 陳 陽

（皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

一種建立大鼠動(dòng)脈硬化模型的方法

張 憲 陳 陽

（皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

目的利用大劑量維生素D3注射和高脂喂養(yǎng)結(jié)合的方法建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型。方法6周齡雄性SD大鼠腹腔注射維生素D3，高脂飼料喂養(yǎng)大鼠。連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠不同時(shí)間段的血脂水平、血液生化指標(biāo)以及其病理變化。結(jié)果①AS模型組的TC、TG、HDL、LDL、血鈣（Ca2+）顯著高于正常對(duì)照組。②HE染色，模型組大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)膜下可見巨噬細(xì)胞及鈣沉積，內(nèi)彈力膜斷裂，少量斑塊沉積，而正常大鼠無病變的產(chǎn)生。結(jié)論該方法能夠誘導(dǎo)大鼠高脂血癥癥狀的發(fā)生，并逐漸在動(dòng)脈內(nèi)膜下形成粥樣斑塊，大鼠動(dòng)脈硬化模型可成功建立。

動(dòng)脈粥樣硬化；模型；大鼠；病理學(xué)

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種病因復(fù)雜的慢性疾病，其以脂質(zhì)代謝紊亂、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、斑塊破裂和血栓形成為基本特征，為心腦血管疾病重要的病理基礎(chǔ)。然而對(duì)其病因、發(fā)病機(jī)制和防治的研究有賴于動(dòng)物模型。有用兔、小型豬、鼠、猴等動(dòng)物建立動(dòng)脈粥樣硬化病理模型的報(bào)道[1-4]。本實(shí)驗(yàn)利用大劑量維生素D3腹腔注射與高脂飼料喂養(yǎng)相結(jié)合的方法，建立了操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好的大鼠AS模型，為AS發(fā)病機(jī)制闡明和心腦血管疾病的預(yù)防創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)SD大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：普通級(jí)SCXK（蘇）2008-0010，于恒溫（24±1） ℃及濕度為（42 ±5）%的條件下，每籠1只，共80籠，24 h自由攝水，兩組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在6周齡的SD大鼠上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前采血測(cè)定動(dòng)物的血脂及血鈣水平。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）、膽固醇干粉（普博欣生物科技有限公司）、膽酸鈉（北京化學(xué)試劑公司)、豬油和白糖（江蘇省協(xié)同生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）、丙基硫氧嘧啶（北京紅惠生物制藥股份有限公司）。

1.3 建立動(dòng)物模型：70只6周齡SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組(正常組30只和模型組40只)：正常組給予普通飼料；模型組的大鼠通過腹腔注射維生素D3注射液（60萬U/kg），每隔1天1次，共3次同時(shí)給予高脂飼料喂養(yǎng)(4%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬大油、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶，80.3%的基礎(chǔ)飼料)。并定期喂以瓜子和雜食，改善其腸胃功能，增強(qiáng)抵抗力。喂食每次10 g，每天2次，自由飲水。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于不同時(shí)間段用大鼠尾靜脈取血法采血1 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7600)測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白(LDL)、血鈣（Ca2+）水平。

1.5 病理組織學(xué)檢查：于高脂喂養(yǎng)后第9周分別在正常組及模型組隨機(jī)抽取5只大鼠，用1%戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，取完整主動(dòng)脈(從主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分叉處)，用10%甲醛固定主動(dòng)脈，對(duì)其進(jìn)行石蠟包埋連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察主動(dòng)脈內(nèi)膜變化。

2 結(jié) 果

2.1 不同階段大鼠血脂、血鈣水平變化：大鼠高脂喂養(yǎng)前1 d、21 d后、42 d后各采一次血，采血前禁食12 h。63 d后處死動(dòng)物，處死前禁食12 h，頸動(dòng)脈取血放于離心管中，取血前向離心管中加入枸櫞酸鈉抗凝，血液經(jīng)3000 r/min離心10 min，用于生化測(cè)定。所測(cè)血脂情況見表1。模型組動(dòng)物血脂(TC、TG、HDL、LDL)及血鈣（Ca2+）水平明顯升高(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間段各組血脂及血鈣的比較()

表1 不同時(shí)間段各組血脂及血鈣的比較()

注：*各時(shí)間段模型組與一天模型組比較，P＜0.05（NG：正常組；MG：模型組）

指標(biāo) 1 d NG 1 d MG 21 d MG 42 d MG 63 d MG TC(mmol/L) 1.11±0.04 1.11±0.05 4.82±0.12* 9.05±0.12*12.60±1.15* TG(mmol/L) 0.25±0.02 0.25±0.02 0.24±0.02 0.36±0.04* 0.46±0.04* HDL(mmol/L)0.93±0.12 0.93±0.13 2.24±0.12 3.16±0.58* 4.27±0.07* LDL(mmol/L)0.19±0.03 0.19±0.03 0.49±0.09* 1.27±0.06* 3.21±0.12* Ca2+(mmol/L)1.82±0.03 1.82±0.03 2.75±0.15* 3.47±0.03* 4.77±0.06* BW(g) 182±4.51 181±4.49 258±2.45 298±5.16 310±3.52

2.2 主動(dòng)脈切片HE染色：大鼠主動(dòng)脈切片HE染色結(jié)果見圖1，光學(xué)顯微鏡下模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜下可見巨噬細(xì)胞及鈣沉積，內(nèi)彈力膜斷裂，少量斑塊沉積，而正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列規(guī)整。

3 討 論

圖1 大鼠主動(dòng)脈HE染色（×400）

動(dòng)脈粥樣硬化與人類心腦血管疾病密切相關(guān)，對(duì)心腦血管疾病的病因、發(fā)病機(jī)制以預(yù)防的研究離不開動(dòng)物模型的建立，國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道有用兔子建立動(dòng)脈粥樣硬化模型，用高脂喂養(yǎng)的方法，8～12周可在兔動(dòng)脈內(nèi)見脂質(zhì)條紋，約45周可形成成熟動(dòng)脈粥樣硬化[5]。Abela GS[6]對(duì)新西蘭白兔行球囊損傷主動(dòng)脈加高脂飼養(yǎng)的方法，12周產(chǎn)生嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬，后經(jīng)組胺誘發(fā)斑塊破裂，成功建成不穩(wěn)定斑塊破裂模型。然而兔是食草動(dòng)物，其飲食習(xí)慣與人類大不相同，其產(chǎn)生的斑塊與人類的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊區(qū)別甚大。Schneider J.E等[2]也對(duì)豬冠狀動(dòng)脈用球囊損傷的方法成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。但是豬體積大，用于動(dòng)脈硬化模型的建造不便于操作，且成本高。大鼠盡管具有一定的抗AS特性，但它用于模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，飼養(yǎng)方便，成本低，生存能力強(qiáng)，病死率較低。同時(shí)，大鼠為雜食類動(dòng)物，飲食習(xí)慣與人類相似，生理解剖亦與人類相似，故較多研究選用大鼠建立動(dòng)脈硬化模型。

研究發(fā)現(xiàn)，AS最顯著的特征是動(dòng)脈壁鈣化和動(dòng)脈壁的脂質(zhì)沉積。人類AS的沉積物中鈣磷的含量可達(dá)71%，其含量與AS病變程度呈正相關(guān)[7-8]。維生素D3可促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣磷的吸收，大劑量的維生素D3可使鈣離子在動(dòng)脈內(nèi)膜下沉積，使動(dòng)脈發(fā)生鈣化[9]，所以許多研究以大劑量維生素D3，作為誘導(dǎo)劑建立動(dòng)物模型。本試驗(yàn)遵循該致病機(jī)制的大體思路，將大劑量維生素D作為誘導(dǎo)劑對(duì)大鼠進(jìn)行誘導(dǎo)。大量實(shí)驗(yàn)與臨床資料證明高脂血癥是AS形成的主要危險(xiǎn)因素[10]。因此本實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)與大劑量維生素D3腹腔注射結(jié)合的方法，在參考前人的基礎(chǔ)上對(duì)高脂飼料配方及維生素D3劑量作了改變，9周后成功建立動(dòng)脈粥樣硬化模型?？傊?，用此方法建立動(dòng)脈粥樣硬化模型可操作性強(qiáng)，周期較短，為研究動(dòng)脈粥樣硬化奠定可靠基礎(chǔ)。

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Establishment of a Rat Atherosclerosis Model

ZHANG Xian, CHEN Yang
(Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

ObjectiveTo establish a rat atherosclerosis(AS) model by combination of vitamin D3intraperitoneal injection and high-fat feeding.MethodsThe rat model was established by the following procedure: 6 week old male SD rats were fed with high-fat diet with a combination of intraperitoneal injection of vitamin D3at a dosage of 60 U/kg every other day. Continuous monitoring of the level of lipids, blood biochemical parameters and pathological changes in rats at different periods.Results①AS model groups TC, TG, HDL, LDL, Ca2+is significantly higher than the normal control group. ②HE stain, the following pathological changes can be seen in the artery of model group: numerous foam cells, atheronecrotic substances and calcification presentation, internal elastic membrane rupture and plaque deposition. Yet these changes can not be seen in normal group.ConclusionsThis method can induce symptoms of hyperlipidemia in rats, and gradually lead to formation of atherosclerotic plaque in the arteries, thus atherosclerosis model in rats can be successfully established.

Atherosclerosis; Model; Rat; Pathology

R36；R-33

B

1671-8194（2015）03-0004-02