王 明(1．天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;2．寧夏泰瑞制藥股份有限公司，寧夏銀川750101)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)是20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素族成員，是一種廣譜抗菌藥物，在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的用途和廣闊的市場前景［1］。目前土霉素均采用龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)通過發(fā)酵法生產(chǎn)。影響土霉素發(fā)酵產(chǎn)量的因素較多，主要包括菌株自身的生產(chǎn)能力、發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件參數(shù)，其中研究主要集中在生產(chǎn)菌株的選育［2－4］。在工業(yè)化生產(chǎn)中，由于土霉素發(fā)酵培養(yǎng)基組成較復(fù)雜，玉米漿、黃豆餅粉等原料質(zhì)量差異較大，易帶來發(fā)酵過程與目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的波動。響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology，簡稱RSM)在優(yōu)化研究中應(yīng)用頻繁，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中實際問題的一種有效方法，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域［5－7］。目前寧夏泰瑞制藥股份有限公司土霉素生產(chǎn)工藝優(yōu)化課題組采用菌種誘變技術(shù)成功篩選得到一株土霉素高產(chǎn)菌株S189，筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，為該菌株發(fā)酵性能的發(fā)揮提供良好條件。

1 材料與方法

1．1 菌種 土霉素高產(chǎn)菌株:龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)S189，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所保存。

1．2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基:麩皮70 g/L和瓊脂25 g/L，pH調(diào)至6．8 ～7．0。種子培養(yǎng)基:淀粉 16 g/L，糊精 12 g/L，黃豆餅粉5 g/L，玉米漿2 g/L，硫酸銨4 g/L，氯化鈉4 g/L，碳酸鈣4 g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基:黃豆餅粉25 g/L，玉米漿8 g/L，淀粉75 g/L，硫酸銨8 g/L，氯化鈉2 g/L，碳酸鈣6 g/L，磷酸二氫鉀0．3 g/L。配制培養(yǎng)基時先用培養(yǎng)基總體積50%的純化水將淀粉溶解后，加入淀粉總質(zhì)量0．006 5%的高溫淀粉酶，放入沸水浴中邊攪拌邊糊化，約20 min，再于其他成分混合配制。

1．3 培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng):(36．5 ±1．0)℃，65 ～72 h，(30．0±1．0)℃，20～24 h。種子培養(yǎng):將已生長好的斜面孢子刮(2～3)cm2至種子培養(yǎng)基中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培養(yǎng)20～24 h。發(fā)酵培養(yǎng):用吸管吸取一定量已生長好的種子液，接入發(fā)酵瓶中，(30．0 ±1．0)℃，230 r/min 培養(yǎng)150 ～192 h。

1．4 分析方法 將發(fā)酵液用草酸酸化至pH 1．50～1．70，放置5 min，用中速濾紙過濾至5 ml以上，吸取濾液稀釋適宜倍數(shù)(使稀釋后效價在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi))，用移液管吸取1 ml稀釋液于試管中，準(zhǔn)確加入0．01 mol/L鹽酸，使總體積為20 ml，再加入0．05%(g/ml)的三氯化鐵溶液10 ml，使總體積為20 ml，搖勻，放置20 min。另取1 ml稀釋液，加入0．01 mol/L的鹽酸19 ml，使總體積為20 ml，搖勻，放置20 min，作為空白，放置20 min。在480 nm波長下測定2種液體吸光度。將測定的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再乘以稀釋倍數(shù)即得效價。土霉素效價的測定:采用紫外分光光度計法，參照文獻［2］。

1．5 Packett-Burman試驗設(shè)計(簡稱PB試驗) 根據(jù)前期發(fā)酵經(jīng)驗和單因素試驗結(jié)果，選取培養(yǎng)基中7個因素，進行N=12的 Packett-Burman設(shè)計試驗，篩選出重要影響因子［8－10］。

1．6 最陡爬坡試驗 響應(yīng)面擬合方程只有在接近最佳值區(qū)域才近似真實情況，因此要先逼近此區(qū)域才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程，通常用最陡爬坡法快速逼近最佳值區(qū)域。最陡爬坡法以PB試驗結(jié)果為依據(jù)，爬坡路徑與主要因素的效應(yīng)一致。對篩選出的因子根據(jù)方程進行最陡爬坡設(shè)計，以坡的最高點作為后續(xù)中心組合的中心點。

1．7 響應(yīng)面分析 根據(jù)PB和最陡爬坡試驗結(jié)果找到的中心點，利用Design-Expert響應(yīng)面分析中的中心組合設(shè)計方法(CCD)進行試驗［8］，得到優(yōu)化后的理論結(jié)果，進行3次重復(fù)驗證。

2 結(jié)果與分析

2．1 PB試驗設(shè)計及影響顯著因子的確定 采用Design-Expert．V8．0．6 軟件中 Packett-Burman 試驗設(shè)計，根據(jù)龜裂鏈霉菌的發(fā)酵特點，采用N=12的PB設(shè)計表，對發(fā)酵培養(yǎng)基中黃豆餅粉(A)、玉米漿(B)、淀粉(C)、硫酸銨(D)、氯化鈉(E)、碳酸鈣(F)、磷酸二氫鉀(G)7個因素進行考察。每個因素取高、低2個水平，培養(yǎng)160 h，發(fā)酵液經(jīng)草酸酸化過濾后采用分光光度計檢測土霉素效價(mg/L)，作為PB試驗的響應(yīng)值(Y)，另設(shè)3個虛擬變量，考察試驗誤差，試驗設(shè)計及結(jié)果分析見表1、2。

表1 PB試驗因素水平及編碼 g/L

表2 PB試驗設(shè)計與結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，PB試驗中變量A、變量B、變量F均顯著。變量A、B、F的模型貢獻率較高，為構(gòu)成模型的主要因素。因此，玉米漿、黃豆餅粉、碳酸鈣是影響土霉素發(fā)酵效價的重要因素，利用軟件可得到關(guān)于響應(yīng)值的多元一次回歸方程:Y=21．28+2．66 A+1．68 B+1．31 C －0．21 D+0．28 E+2．59 F+0．042 G，R2=0．929 2，所選模型顯著。

2．2 爬坡試驗 最陡爬坡法以PB試驗結(jié)果為依據(jù)，爬坡路徑與主要因素的效應(yīng)一致。黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣均呈正效應(yīng)增加，根據(jù)這3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定他們的變化方向及步長。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，由表3可知，最佳條件為試驗3，因此選取黃豆餅粉40．0 g/L，玉米漿15．0 g/L，碳酸鈣12．0 g/L作為優(yōu)化試驗的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果

2．3 中心組合試驗及響應(yīng)面分析 根據(jù)PB和最陡爬坡試驗結(jié)果，采用黃豆餅粉40 g/L，玉米漿15 g/L，碳酸鈣12 g/L為中心點，利用Design-Expert響應(yīng)面分析中的中心組合設(shè)計方法(CCD)進行試驗［11］，結(jié)果見表 4。

表4 中心組合設(shè)計及試驗結(jié)果

利用Design-Expert軟件進行二次回歸，得到響應(yīng)值擬合方程 R1=+28．85+1．40A+1．43B+1．25C －0．15AB －0．28 AC+0．075BC －2．00A2－1．24B2－0．45C2。由此方程進行方差分析，結(jié)果表明，建立的回歸模型顯著(P＜0．05)，說明方程擬合度較好;Pr失擬項并不顯著，說明殘差由隨機誤差而引起，模型選擇正確;模型相關(guān)系數(shù)R2=0．916 6，接近1，表明模型擬合較好，能夠較好地描述該試驗結(jié)果。

由回歸方程所作出的響應(yīng)面立體分析圖(圖1～3)顯示，它們分別反映了黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣這3個因素之間兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響，通過比較相應(yīng)曲面的陡峭性狀，可以看出因素A、B、C都隨著量的加大土霉素效價逐步升高，當(dāng)超過最佳值時，土霉素效價開始下降。

利用軟件Numerical Optimization功能預(yù)測響應(yīng)值最大值時，模型各因素的組合為黃豆餅粉41．0 g/L、玉米漿16．4 g/L、碳酸鈣 12．8 g/L，預(yù)測效價為 30．25 mg/L。

圖1 玉米漿和黃豆餅粉對效價的影響

圖2 碳酸鈣和黃豆餅粉對效價的影響

圖3 碳酸鈣和玉米漿對效價的影響

2．4 驗證試驗 為驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，以響應(yīng)面試驗確定的主要因素最優(yōu)組合配制培養(yǎng)基進行發(fā)酵，重復(fù)3次，同時以優(yōu)化前的原始發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照。結(jié)果顯示，土霉素平均產(chǎn)量由24．34 mg/L上升到29．8 mg/L，與預(yù)測結(jié)果接近，說明響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基與預(yù)測結(jié)果接近。

3 結(jié)論與討論

微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生受到非常復(fù)雜的調(diào)節(jié)，發(fā)酵培養(yǎng)基對代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量有較大影響，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基種類或優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，可以提高微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

該研究篩選出影響土霉素產(chǎn)量的3個因素——黃豆餅粉、玉米漿、碳酸鈣，再通過最陡爬坡試驗和CCD試驗進行優(yōu)化與評價，得到影響土霉素的二次多項式回歸模型，利用統(tǒng)計學(xué)方法對該模型進行顯著性檢驗，在含有黃豆餅粉41．0 g/L、玉米漿16．4 g/L、碳酸鈣12．8 g/L培養(yǎng)基成分組成下，土霉素搖瓶產(chǎn)量預(yù)測值達30．25 mg/L。經(jīng)驗證試驗S189菌株經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)量可達29．8 mg/L，與理論預(yù)測值基本吻合，比優(yōu)化前提高24．3%，由此可見，應(yīng)用響應(yīng)面法進行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，提高微生物次級代謝產(chǎn)物的方法是經(jīng)濟有效、科學(xué)合理的。

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