田爽，王曉萍

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025)

氟磺胺草醚，也稱虎威、北極星、氟磺草醚、除豆莠，是由英國捷利康公司開發(fā)的二苯醚類選擇性除草劑，1988年首次出口到我國，1994年開始在國內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)，目前已在我國登記197個(gè)品次，用量居于世界除草劑的第7位［1－4］。大多數(shù)除草劑微生物降解除草劑都屬于酶促反應(yīng)［5］。常見的降解酶主要有如磷酸酶等的水解酶和如漆酶等的氧化還原酶兩大類［6］。降解酶在微生物細(xì)胞中分布的位置因農(nóng)藥種類的不同而異。近年來國內(nèi)已有報(bào)道一些降解酶屬于胞內(nèi)酶［7－10］和胞外酶［11－13］，也有一些分布在如細(xì)胞周質(zhì)［14－15］和細(xì)胞間質(zhì)中等其他部位［16－17］。微生物不同位置的酶可能都與降解污染物的過程有關(guān)［18］。目前在農(nóng)藥酶降解領(lǐng)域研究比較廣泛的是菊酯類農(nóng)藥、三氮苯類農(nóng)藥和有機(jī)磷類農(nóng)藥等［16，19－21］，對(duì)于氟磺胺草醚降解酶的研究及其應(yīng)用方面尚未見報(bào)道。因此，研究氟磺胺草醚降解酶以及利用該酶凈化環(huán)境中的氟磺胺草醚具有重要的現(xiàn)實(shí)價(jià)值和應(yīng)用前景。為此，筆者通過采用紫外分光光度法測(cè)定酶活力來對(duì)氟磺胺草醚降解菌株F12提取的降解酶進(jìn)行定位，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以期為解決氟磺胺草醚使用過程中出現(xiàn)的環(huán)境問題提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)菌株。供試菌為哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院篩選、保存的降解菌株F12(克雷伯氏菌屬Klebsiella sp．)。

1．1．2 藥劑與試劑。99．0%氟磺胺草醚標(biāo)準(zhǔn)品以及所有試劑均購自黑龍江省哈爾濱市南崗區(qū)百特化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1．1．3 主要儀器。超純水系統(tǒng)(德國 USF PURELAB PLUS);電子天平(Bsz10s型，Sartorius公司);pH計(jì)(PB-21型，Sartorius公司);全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋(日本Sanyo公司);微量移液器(法國Gilson公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9145A，上海凱朗儀器設(shè)備廠);超凈工作臺(tái)(新加坡Esco公司);超低溫冷凍冰箱(日本Sanyo公司);恒溫?fù)u床(HZS-H型，國產(chǎn));低溫冷凍離心機(jī)(Allegra 21R型，美國Beckman公司);超聲波細(xì)胞破碎儀(Serial No．157型，英國公司);恒溫水浴鍋(RTE-111型，Neslab公司)。

1．2 方法

1．2．1 氟磺胺草醚最佳吸收波長的選擇。吸取1．0 ml氟磺胺草醚標(biāo)準(zhǔn)液于比色皿中，選擇波長范圍為550～690 nm，先每隔50 nm波長測(cè)定一次氟磺胺草醚吸光度，確定大致范圍，再分別依次每隔10、5和1 nm波長測(cè)吸光度以確定氟磺胺草醚的最佳吸收波長。

1．2．2 細(xì)胞生長與產(chǎn)酶特性研究。分別在發(fā)酵培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d時(shí)測(cè)定發(fā)酵過程中氟磺胺草醚降解酶酶活性、菌體的生長情況及pH變化，采用紫外分光光度法測(cè)定菌體的生長情況及氟磺胺草醚的降解酶酶活性，以發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以氟磺胺草醚降解酶酶活性、菌體的生長情況(OD600)和pH為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1．2．3 氟磺胺草醚降解酶的提取及定位。取出4℃冰箱保存的菌種平板，挑取單菌落加入到LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～18 h(OD600≈0．3)。將菌株活化后制成菌懸液，以15%的接種量接入50．0 ml新鮮配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)2 d。取10．0 ml發(fā)酵后的菌液7 000 r/min離心10 min，收集上清液和菌體沉淀物。上清液經(jīng)0．22 μm的微孔濾膜過濾除菌，根據(jù)無菌濾液的體積邊攪拌邊加適量碾細(xì)的(NH)2SO4粉末，混勻至100%的飽和度，4℃鹽析過夜，離心收集蛋白沉淀。用 0．05 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖液(pH 7．0)溶解后，再用緩沖液透析至無亞硫酸離子，合并透析液，即胞外粗酶液。菌體沉淀用緩沖液洗滌3次，再將菌體按1∶3(g/ml)的比例懸于緩沖溶液中，在冰浴中用超聲波破碎菌體，然后7 000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀。上清液經(jīng)微孔濾膜過濾，得胞內(nèi)粗酶液。離心后的沉淀用緩沖液重懸，得菌體細(xì)胞碎片懸浮液。測(cè)定降解菌株不同組分的酶活性，確定降解酶的位置。取酶活大者作為發(fā)酵粗酶液。

1．2．4 氟磺胺草醚降解酶活力測(cè)定。反應(yīng)體系為3．0 ml，將1．0 ml緩沖溶液、1．0 ml 100 mg/L氟磺胺草醚藥液以及1．0 ml粗酶液在35℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5 min，將粗酶液加入到緩沖液和藥液中，置于35℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min，加入0．2 ml 1．00 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。以添加相同體積的蒸餾水且未添加降解酶液的氟磺胺草醚－緩沖液為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，取其平均值。將終止反應(yīng)后的溶液滴入比色皿中，在661 nm波長下分別測(cè)定反應(yīng)前后所對(duì)應(yīng)氟磺胺草醚含量的吸光度。在該試驗(yàn)條件下，將1 min使吸光度下降0．001 定義為1 個(gè)酶活力單位［12］。

1．2．5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解酶活力的影響。向含有100 mg/L氟磺胺草醚的緩沖溶液［緩沖液為0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］體系中加入粗酶液，于35℃恒溫水浴中進(jìn)行酶促反應(yīng)。分別在反應(yīng)進(jìn)行 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50和60 min時(shí)終止反應(yīng)，在不同反應(yīng)時(shí)間下分別設(shè)置不添加酶液的處理為對(duì)照組，測(cè)定酶活力。

1．2．6 酶濃度對(duì)降解酶活力的影響。在含有100 mg/L氟磺胺草醚緩沖溶液［緩沖液為0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］體系中分別加入 0．2、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2 和1．4 ml降解粗酶液，使最終測(cè)定酶活體系為3．0 ml。將混合溶液35℃恒溫水浴30 min后終止反應(yīng)，設(shè)置未添加粗酶液的處理為對(duì)照組，測(cè)定酶活力。

1．2．7 pH 對(duì)降解酶活力的影響。在 pH 分別為 5．5、6．0、6．5、7．0、7．5、8．0 和 8．5 的 1．0 ml磷酸鹽緩沖溶液中加入1．0 ml氟磺胺草醚溶液，再各加入1．0 ml 35℃預(yù)熱的粗酶液，35℃恒溫水浴30 min時(shí)終止反應(yīng)。在不同的pH下分別設(shè)置不添加酶液的處理為對(duì)照組，測(cè)定酶活力。

1．2．8 溫度對(duì)降解酶活力的影響。在2．0 ml含有100 mg/L氟磺胺草醚的緩沖溶液［緩沖液為0．05 mol/L KH2PO4-NaOH(pH 7．5)］體系中加入 1．0 ml粗酶液，分別置于 20、25、30、35、40、45 和50 ℃恒溫水浴 30 min 后終止反應(yīng)，在不同反應(yīng)溫度下分別設(shè)置不添加酶液的處理為對(duì)照組，測(cè)定酶活力。

1．2．9 藥濃度對(duì)降解酶活力的影響。在1．0 ml緩沖溶液(pH7．5)中分別加入1．0 ml降解粗酶液，添加1．0 ml濃度分別為10、50、75、100、150、200 和 300 mg/L 的氟磺胺草醚藥液，使最終測(cè)定酶活體系為3．0 ml。將混合液于35℃恒溫水浴30 min后終止反應(yīng)，以未添加粗酶液的處理為對(duì)照組測(cè)定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2．1 氟磺胺草醚最佳吸收波長的選擇 經(jīng)過測(cè)定，吸光值在波長為661 nm時(shí)達(dá)到最高值(圖1)，即氟磺胺草醚最佳吸收波長為661 nm。

2．2 細(xì)胞生長與產(chǎn)酶特性 由圖2可知，氟磺胺草醚降解酶的酶活性在培養(yǎng)的1～3 d內(nèi)大幅度增加，在第3天達(dá)到最大值［2．653 λ/(U·ml)］。從第3天開始酶活性一直處于降低狀態(tài)。發(fā)酵培養(yǎng)1 d后，降解菌菌體數(shù)量迅速增大，在發(fā)酵培養(yǎng)的第2～4天菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定，在第4～7天菌體數(shù)量大量減少，處于衰亡期。在發(fā)酵培養(yǎng)的7 d內(nèi)，培養(yǎng)基的pH一直處于降低的狀態(tài)，在第2天pH降低幅度最大，最高值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第1天，為7．1，最低值出現(xiàn)在第7天，為6．1。

2．3 氟磺胺草醚降解酶的定位 采用紫外分光光度法分別測(cè)定氟磺胺草醚總酶液、胞外粗酶液、胞內(nèi)粗酶液以及細(xì)胞碎片懸浮液的酶活性，胞外粗酶液的酶活性遠(yuǎn)高于胞內(nèi)粗酶液和細(xì)胞碎片懸浮液，達(dá)到1．971 λ/(U·ml)，占總酶液的75．895%(圖3)，由此推斷氟磺胺草醚降解菌株F12合成的降解酶大部分分泌至胞外，即屬于胞外酶。

2．4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)降解酶活力的影響 由圖4可知，在35℃、0．05 mol/L緩沖液(pH 7．5)中，氟磺胺草醚的降解酶活性在5～30 min范圍內(nèi)隨著時(shí)間的增加逐漸增大。當(dāng)時(shí)間超過30 min時(shí)，降解酶的活性隨時(shí)間的增加而減小。因此，氟磺胺草醚降解酶酶活力測(cè)定應(yīng)于30 min時(shí)終止反應(yīng)，即氟磺胺草醚降解酶最適酶促反應(yīng)終止時(shí)間為30 min。

2．5 酶濃度對(duì)降解酶活力的影響 由圖5可知，在0．2～1．0 ml降解酶酶濃度范圍內(nèi)氟磺胺草醚降解酶酶活力隨著酶濃度的增加而大幅增加，在0．2～0．6 ml降解酶酶濃度范圍內(nèi)隨酶濃度的增加斜率增加，在0．6～0．8 ml降解酶酶濃度范圍內(nèi)斜率有所下降，在0．8～1．0 ml范圍內(nèi)增加趨勢(shì)趨于平緩，在酶濃度為1．0 ml時(shí)降解酶酶活性達(dá)到最大值，為1．937 λ/(U·ml)。在酶濃度超過 1．0 ml時(shí)，降解酶酶活性隨著酶濃度的增加而大幅減小，這可能是由于較高濃度的粗酶液中含有能夠抑制氟磺胺草醚降解的物質(zhì)，導(dǎo)致降解酶活性有所下降的緣故。由此可以確定氟磺胺草醚降解酶最適的酶促反應(yīng)酶濃度為1．0 ml。

2．6 pH對(duì)降解酶活力的影響 由圖6可知，在pH為5．5～7．5的范圍內(nèi)氟磺胺草醚降解酶酶活力隨pH增加呈逐漸上升趨勢(shì)，在pH為7．5時(shí)降解酶酶活力達(dá)到最大值，為1．882 λ/(U·ml)。在 pH 范圍為7．5 ～8．5 時(shí)降解酶酶活力逐漸下降，且直線斜率大于pH為7．0～7．5的斜率，說明氟磺胺草醚降解酶在中性偏堿性條件下表現(xiàn)出較高的酶活力。由此可以推斷氟磺胺草醚降解酶最適酶促反應(yīng)pH為7．5。

2．7 溫度對(duì)降解酶活力的影響 由圖7可知，當(dāng)溫度升至35℃時(shí)酶活力達(dá)到最高值［1．927 λ/(U·ml)］。升高或降低溫度都不利于降解酶酶活性的增加，究其原因可能是菌體在過高或過低溫度下菌體生長緩慢，不利于菌體產(chǎn)酶。由此可以確定氟磺胺草醚降解酶最適酶促反應(yīng)溫度為35℃。

2．8 藥濃度對(duì)降解酶活力的影響 由圖8可知，在藥濃度為150 mg/L時(shí)降解酶酶活性達(dá)到最大值，為1．844 λ/(U·ml)。過高或過低的藥液濃度都不利于菌株的酶活性增加，究其原因可能是較高或較低濃度的氟磺胺草醚藥液抑制了氟磺胺草醚的降解，導(dǎo)致降解酶酶活性的下降。由此可以確定氟磺胺草醚降解酶最適反應(yīng)藥濃度為150 mg/L。

3 結(jié)論與討論

采用紫外分光光度法測(cè)定酶活力，對(duì)氟磺胺草醚降解菌株F12降解酶粗酶液的提取的酶進(jìn)行定位，經(jīng)鑒定其降解酶屬于胞外酶，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該菌株最適的酶促反應(yīng)條件:時(shí)間為30 min，酶濃度為1．0 ml，pH為7．5，溫度為35℃，藥濃度為150 mg/L。

大多數(shù)微生物降解農(nóng)藥的反應(yīng)屬于酶促反應(yīng)，降解酶在細(xì)胞中的位置對(duì)于不同的農(nóng)藥來說是不同的，如果降解酶屬于胞外酶，則無菌體的富集培養(yǎng)基可以高效降解農(nóng)藥;如果降解酶屬于胞內(nèi)酶，則胞內(nèi)粗提液對(duì)農(nóng)藥有較高的降解性;如果降解酶屬于胞壁酶，則細(xì)胞碎片懸浮液對(duì)農(nóng)藥的降解性較高［10］。酶促反應(yīng)易受環(huán)境條件的影響［22］，該研究對(duì)菌株的降解酶進(jìn)行了定位并探索了最適酶促反應(yīng)時(shí)間、酶濃度、pH、溫度以及藥濃度，為規(guī)?；a(chǎn)氟磺胺草醚降解酶制劑及治理污染土壤提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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