張東來，張 玲 (.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱5008;2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江哈爾濱5008)

自然界中雌雄異株的植物僅占6%，不同性別的植物具有不同的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究雌雄異株植物性別及其鑒定在理論與實(shí)踐中都具有重要意義［1］。例如以種子和果實(shí)為收獲對(duì)象時(shí)需大量的雌株，而獲取以營養(yǎng)器官生長為主的綠化林木有時(shí)雄株具更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

黃菠蘿(Phellodendron amurense Rupr.)是東北三大硬闊樹種之一，為國家一級(jí)珍貴樹種、國家2級(jí)保護(hù)樹種和易危物種［2］。黃菠蘿不僅木材具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且還是珍貴的藥用植物。黃菠蘿為雌雄異株植物，性成熟前無法鑒別其植株性別，一般的樹木要到5～8年才能性成熟，且雌雄鑒定主要在開花期間進(jìn)行，因此黃菠蘿苗木的早期性別鑒定就成了林業(yè)科研及營林生產(chǎn)中亟待解決的一個(gè)問題［3］。雌雄異株樹種的性別鑒定方法很多種［4－8］，包括形態(tài)鑒別法、生理指標(biāo)鑒別法、化學(xué)物質(zhì)分析鑒別法、同工酶圖譜鑒別法等。目前已報(bào)道的雌雄鑒定植物種類有紅松、水曲柳、栝樓、中華獼猴桃、沙棘、銀杏等［4－9］。黃菠蘿葉片中富含多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，該研究采用形態(tài)學(xué)方法、化學(xué)方法(甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑法)及生理學(xué)方法(保護(hù)酶活性)等，通過分析成熟黃菠蘿葉片提取液顏色和光譜吸收值與其性別之間的關(guān)系，探索黃菠蘿幼苗早期性別鑒定技術(shù)，為黃菠蘿人工林恢復(fù)和營林生產(chǎn)提供理論參考［9］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 以哈爾濱市香坊區(qū)松樂公園黃菠蘿成樹為試驗(yàn)植株，樹齡平均為40年，郁閉度為0.7左右，林內(nèi)伴生種為白樺、水曲柳、山楊、榆樹等，灌木為紫丁香、金銀忍冬等。分別在2013年、2014年6月中旬，隨機(jī)取黃菠蘿雌雄株各30株，在每株樣樹樹冠上、中、下3個(gè)層次的東、南、西、北4個(gè)方向采摘葉片，將同株樣樹上所采摘的葉片充分混合裝入袋內(nèi)，迅速放入冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰箱中，冷藏，待測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基紅染色法。按雌雄株分別選取幼葉，洗凈、拭干，稱1 g，加入蒸餾水10 ml，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液，等量加入2 g/L甲基紅溶液，混勻，置于30℃恒溫水浴中保溫，每隔3 h記錄提取液的顏色變化［4］。

1.2.2 溴麝香草酚藍(lán)法(BTB法)。稱取葉片1 g，加入10 ml蒸餾水，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液2 ml，加入1 g/L的堿性BTB溶液4～5滴，于30℃的恒溫下保溫，觀察其顏色變化，并每隔4 h用分光光度計(jì)測(cè)定其在400～730 nm(每隔30 nm測(cè)吸收值)的吸收值［4］。

1.2.3 氯化三苯基四氮藍(lán)唑法(TTC法)。取葉片0.5 g，剪成小塊，放入試管，加入4 g/L TTC溶液和0.067 mol/L pH=7.0磷酸緩沖液各5 ml，使樣品完全浸入到反應(yīng)液中，置于常溫下浸提2 h，然后加入1 mol硫酸2 ml以終止反應(yīng)，取出葉片，用濾紙吸干水分，在研缽中加入3 ml乙酸乙酯及少量石英砂，研碎提取TTCH，用乙酸乙酯洗研缽并將提取液全部轉(zhuǎn)入10 ml試管中，用乙酸乙酯定容到10 ml，在485～690 nm下測(cè)定吸光值［4］。

1.2.4 斐林試劑法。取葉片1 g，加入10 ml蒸餾水，研磨成勻漿，室溫浸提1 h，10 000 r/min離心5 min，取上清液5 ml，分別加入斐林試劑各1 ml，觀察顏色變化及沉淀，在480～690 nm下測(cè)定吸光值［9］。

1.2.5 CAT、POD、SOD 酶活性測(cè)定。酶液提取:稱取 1.0 g新鮮黃菠蘿葉片，液氮研磨，加入6 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，10 000 r/min 離心10 min，取上清液［2］。

1.2.5.1 CAT 酶活性測(cè)定。取 40 μl酶液，加入 2.5 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液和1 ml蒸餾水，不加酶液對(duì)照。在30℃水中水浴10 min，加入0.3 ml 0.1 mol/L 的 H2O2，測(cè)定吸光度。

1.2.5.2 POD 酶活性測(cè)定。取100 μl酶液，加入2.9 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液和1 ml 0.1 mol/L愈創(chuàng)木酚，不加酶液為對(duì)照。在30℃水中水浴30 min，加入1 ml 8 g/L H2O2，終止反應(yīng)，測(cè)定吸光值。

1.2.5.3 SOD 酶活性測(cè)定。取 100 μl酶液加 3 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，在正常日光下反應(yīng)20 min，對(duì)照暗處理，測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定。測(cè)定黃菠蘿株高、葉寬、葉長指標(biāo)，結(jié)果見表1。從表1可以看出，黃菠蘿葉片形態(tài)學(xué)鑒定差異性均不顯著(P＞0.05)，黃菠蘿雌雄株株高、葉寬、葉長相關(guān)性較小，其相關(guān)系數(shù)分別為 R2=0.111、R2=0.081、R2=0.117。因此，形態(tài)學(xué)方法不能鑒定黃菠蘿雌雄株。

表1 黃菠蘿葉片形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.1.2 甲基紅溶液鑒定。以成熟黃菠蘿幼葉提取液，加入2 g/L濃度甲基紅溶液，30℃水浴3 h后觀察發(fā)現(xiàn)，向葉部提取液中加入甲基紅溶液時(shí)，雄性植株上清液呈現(xiàn)深紅色，雌性植株為橘紅色，雄雌株顏色開始變淺，繼續(xù)水浴觀察至24 h，發(fā)現(xiàn)雌雄株提取液顏色明顯變淺，48 h后褪去，并有沉淀物。因此采用甲基紅溶液測(cè)定時(shí)，水浴3 h可作為鑒別雄、雌植株性別的最佳時(shí)期(圖1)。

2.1.3 BTB法。采用溴麝香草酚蘭法(BTB法)對(duì)黃菠蘿雄雌株進(jìn)行鑒定，雄雌株提取液顏色差異明顯，雄性植株深藍(lán)色，雌性植株為棕黃色。在吸收光譜方面，雌雄株的提取液吸光值差異顯著(圖2)。在480 nm下測(cè)定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為 2.680 00 ±0.159 63，雌株平均值為1.389 33±0.076 35。BTB方法鑒定的雌雄株吸光值在480～690 nm處的檢驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，認(rèn)為BTB方法鑒定雌雄株的效果是顯著的。因此，BTB方法可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

2.1.4 TTC法。用氯化三苯基四氮藍(lán)唑法(TTC法)對(duì)黃菠蘿雌雄植株性別進(jìn)行鑒定，在吸收光譜方面雌雄株的提取液差異顯著。如圖3所示，在480 nm和660 nm下測(cè)定雌雄株提取液吸光值，雄株平均值為 1.643 67±0.176 79和1.841 33±0.098 20，雌株提取液吸光值為 2.067 33 ±0.145 82和2.145 67 ± 0.124 93，顯著水平為 0.009 9(P ＜0.01)，雌雄株之間具有極顯著差異。因此，TTC方法在480、660 nm下可以作為黃菠蘿雌雄株鑒定的方法。

2.1.5 斐林試劑法。雌雄株提取液采用斐林試劑的顯色反應(yīng)具有明顯差異，雌株呈現(xiàn)草綠色，雄株呈現(xiàn)翠綠色。在480～690 nm吸收光譜下，雌雄株的提取液吸光值存在差異，雄株提取液吸光值為1.532 25±0.037 26，雌株提取液吸光值為1.363 75 ±0.059 23，顯著水平為0.038(0.01 ＜P ＜0.05)，認(rèn)為雌雄株之間存在差異，即可認(rèn)為斐林試劑法可以作為鑒定黃菠蘿雌雄株的方法。

2.1.6 保護(hù)酶活性測(cè)定。以6月份40年生成熟黃菠蘿樹幼嫩葉片提取保護(hù)酶，測(cè)酶活性。從表2中可以看出，黃菠蘿

雌雄株葉片內(nèi)保護(hù)酶活性表現(xiàn)為CAT酶、SOD酶和POD酶活性差異不顯著。因此，測(cè)定葉片保護(hù)酶方法不能作為鑒定雌雄株的方法。

表2 黃菠蘿雌雄株葉片保護(hù)酶活性差異

3 結(jié)論與討論

雌雄株鑒別技術(shù)的應(yīng)用潛力主要在于苗木性別的早期鑒定，該試驗(yàn)所得到的結(jié)果和其他相關(guān)研究所得到的結(jié)果是一致的［9－11］，證明了性別差異與雌雄植株代謝生理有關(guān)。通過連續(xù)2年的試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，采用甲基紅法、BTB法、TTC法和斐林試劑方法進(jìn)行黃菠蘿性別鑒定，結(jié)果顯示雌雄株具有顯著性差異，表明用這4種方法進(jìn)行黃菠蘿雌雄株鑒定是完全可行的。形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方法表現(xiàn)為差異不顯著，因此，形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方法不能作為鑒定黃菠雌雄株的方法。而化學(xué)藥劑方法操作簡單、結(jié)果明顯，而且費(fèi)用低廉，可以對(duì)黃菠蘿幼苗期鑒定提供理論支持，在林業(yè)生產(chǎn)中具有很好應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。這些方法的缺點(diǎn)是容易受到溫度、光強(qiáng)及采樣時(shí)間的影響，因此，需要在今后的工作中綜合研究各種因素對(duì)鑒別結(jié)果的影響(例如內(nèi)源激素的差異)，探索更為合適的措施以縮短鑒別過程所需要的時(shí)間。另外，在染色液的分光光度計(jì)檢測(cè)中的特征吸收峰值可能是提取液中糖類或酚類物質(zhì)與染色劑反應(yīng)后的產(chǎn)物所形成的，這類物質(zhì)還有待進(jìn)一步確定研究。

［1］李瑞麗，盧龍斗，高武軍，等.雌雄異株植物性別鑒定的研究進(jìn)展［J］.廣西植物，2006，26(4):387 －391.

［2］何冬明，嚴(yán)善春，魯藝芳.黃檗葉片內(nèi)保護(hù)酶活性的時(shí)序變化［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(9):37 －39.

［3］趙林森，徐錫增，崔培毅，等.雌雄異株樹種植物性別鑒定的研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，22(1):71 －74.

［4］胡靜.紅松偏雄、偏雌性別型鑒別技術(shù)研究［D］.北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院，2008:20.

［5］紀(jì)麗麗.水曲柳雌雄株鑒別技術(shù)研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2006:35.

［6］詹亞光，紀(jì)麗麗，亓磊，等.水曲柳雌雄株酚類物質(zhì)和幾種氧化酶活性的比較［J］.林業(yè)科學(xué)，2006，42(7):131 －136.

［7］曲超，劉寧俠，字肖萌，等.栝樓雌雄株苗期、花期生理生化指標(biāo)差異的比較研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(24):42 －45.

［8］祖元?jiǎng)?，王延兵，王慧梅，?黃檗(Phellodendron amuranse)葉片總RNA提取方法研究［J］.植物研究，2007，9(5):593 －595.

［9］王在明，廖鏡思.中華獼猴桃雌雄株快速鑒定初報(bào)［J］.福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1982，6(2):83 －84.

［10］陳學(xué)森，鄧秀新，章文才，等.銀杏雌雄株核型及性別早期鑒定［J］.果樹科學(xué)，1997，14(2):87 －90.

［11］王慶亞，郭巧生，孫建云，等.絞股藍(lán)雌雄株的識(shí)別及內(nèi)源激素變化的研究［J］.中國中藥雜志，2004，9(9):837－840.