李峰卿，姚甲寶，曾滿生，厲月橋，袁雅琪，周新華

（中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600）

TDZ對(duì)杏香兔耳風(fēng)組培苗復(fù)壯的影響

李峰卿，姚甲寶，曾滿生，厲月橋，袁雅琪，周新華

（中國林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜 336600）

為了了解TDZ對(duì)組培苗增殖的影響情況，探討了TDZ在衰退組培苗復(fù)壯過程中的作用，以增殖衰退的杏香兔耳風(fēng)組培苗為試驗(yàn)材料，就TDZ的不同添加方式（抽濾滅菌和高壓滅菌）和不同濃度（0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L）處理對(duì)組培苗增殖系數(shù)、有效芽及苗高生長的影響情況進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明：當(dāng)TDZ的濃度＞0.2 mg/L時(shí)，TDZ的添加方式對(duì)組培苗的增殖系數(shù)和有效芽數(shù)均有較大影響，抽濾滅菌后的增殖系數(shù)和有效芽數(shù)要明顯高于高壓滅菌的；不同濃度的TDZ對(duì)有效芽數(shù)和髙生長的影響均有極顯著的差異性（P＜0.01），當(dāng)TDZ濃度為0.8 mg/L時(shí)，苗質(zhì)量總體達(dá)到最優(yōu)，增殖系數(shù)為5.11，達(dá)到了預(yù)期的復(fù)壯效果；最優(yōu)生根培養(yǎng)基配方為1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L。在杏香兔耳風(fēng)組培苗復(fù)壯過程中，TDZ可作為一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑使用。

杏香兔耳風(fēng)；TDZ；組織培養(yǎng)；增殖；復(fù)壯

苯基噻二唑基脲（Thidazuron，TDZ）是西德Schering公司早于1976年就宣布合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物[1]，Mok在對(duì)棉豆的研究中首次發(fā)現(xiàn)其有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素活性[2]，其活性超過了玉米素。近年來，在許多植物的組織培養(yǎng)中，它能誘導(dǎo)離體材料多種途徑形態(tài)發(fā)生，具有生長素和細(xì)胞分裂素的雙重作用[3]，常用作形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)劑。

杏香兔耳風(fēng)Ainsliaea fragransChamp為菊科兔耳風(fēng)屬植物，有白走馬胎、金邊兔耳草、一枝香等別名[4]，是江西特有的重要林下藥用植物，全草可入藥，具有清熱補(bǔ)虛、涼血止血、利濕解毒之功效，其藥用價(jià)值很高。然而，隨著其藥用價(jià)值研究的廣泛和深入，市場(chǎng)用藥量急劇增加，而該植物不僅整株被采集，且采集時(shí)間又在開花結(jié)實(shí)之前，致使野生杏香兔耳風(fēng)資源無法完成世代更替，天然資源日漸枯竭。近幾年，江香梅等人分別以不同的材料作為外植體進(jìn)行了組織培養(yǎng)和快速繁殖的研究[5-7]，但普遍存在組培苗增殖倍數(shù)低、生根率低及移栽成活率低等問題，尚未形成較成熟的快繁技術(shù)體系，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化育苗。以往的相關(guān)研究多采用嘌呤型細(xì)胞分裂素（如6-BA、KT等），但至今還未見到應(yīng)用TDZ對(duì)其組培苗復(fù)壯的研究報(bào)道。筆者在兔耳風(fēng)組培試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，試管苗在離體連續(xù)培養(yǎng)30多代后其生長增殖出現(xiàn)衰退，為了恢復(fù)其生長增殖能力，就TDZ的不同添加方式和不同濃度處理對(duì)其組培苗增殖系數(shù)、有效芽及苗高生長的影響情況進(jìn)行了試驗(yàn)研究，以期建立長久、高效的快繁體系。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)用外植體均取自MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基上繼代增殖一年半以上的杏香兔耳風(fēng)無菌試管苗。

1.2 方 法

1.2.1 TDZ的不同濃度處理

取繼代次數(shù)相同、株高均勻一致的杏香兔耳風(fēng)單株接入以下培養(yǎng)基中：MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L（此為快繁試驗(yàn)中篩選出的最佳培養(yǎng)基）和0.0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L的TDZ，復(fù)壯第一代時(shí)每個(gè)處理接種14瓶，每瓶6株，繼代周期為25 d/次。

1.2.2 激素添加方法

BA和NAA均在滅菌之前加入，TDZ是先將其pH值調(diào)至5.8，經(jīng)0.2 μm的微孔濾膜抽濾滅菌后，待經(jīng)121℃高壓滅菌17 min后的培養(yǎng)基溫度降至60～80 ℃時(shí)再加入。

1.2.3 生根培養(yǎng)

采用如表1的三因素二水平L4（23）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其中A、B、C三因素分別代表有無經(jīng)TDZ復(fù)壯（即TDZ和TDZ0）、NAA濃度（0.02和0.10 mg/L）及IBA濃度（0.02和0.10 mg/L）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design

1.3 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，其蔗糖含量為30 g/L，卡拉膠6.7 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)室的溫度設(shè)為（25±2）℃，濕度為40%～70%，光周期10 h/d，光照強(qiáng)度1 500～2 000 Lx。

1.4 測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在接種30 d后，在接種的14瓶中隨機(jī)抽取6瓶進(jìn)行數(shù)量和高度的統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)包括0.5～1.0 cm的芽數(shù)、＞1.0 cm的芽數(shù)、芽的增殖倍數(shù)、總芽數(shù)、根的數(shù)量，測(cè)量苗高及根的長度。

有效芽＝（0.5～1.0 cm的芽數(shù)）＋（＞1.0 cm的芽數(shù)）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPASS16.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDZ的添加方式對(duì)組培苗增殖生長的影響

TDZ的添加方式對(duì)組培苗增殖生長的影響情況如圖1 所示。由圖1可知，TDZ的添加均提高了組培苗的增殖系數(shù)，隨著TDZ濃度的增加，其增殖系數(shù)呈增加趨勢(shì)，且均在TDZ濃度為0.8 mg/L時(shí)達(dá)到了最大，抽濾滅菌的最大增殖系數(shù)為5.11，而高壓滅菌的最大增殖系數(shù)為4.53，與抽濾滅菌后TDZ濃度分別為0.8和1.0 mg/L的增殖系數(shù)相當(dāng)；相比之下，杏香兔耳風(fēng)的增殖系數(shù)，經(jīng)抽濾滅菌加入TDZ的要明顯高于高壓滅菌加入TDZ的。

圖1 TDZ的添加方式對(duì)組培苗增殖生長的影響Fig. 1 Effect of added ways of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings

TDZ的添加方式對(duì)組培苗的有效芽數(shù)和苗高的影響情況如圖2 所示。由圖2可知，TDZ的添加在一定程度上能促使苗高的增長，但是，TDZ的兩種添加方式對(duì)苗高的影響并不明顯。當(dāng)TDZ經(jīng)高壓滅菌加入時(shí)，組培苗的有效芽個(gè)數(shù)處于持續(xù)增長的趨勢(shì)。而以抽濾滅菌方式添加TDZ后，當(dāng)TDZ的濃度在0.8 mg/L時(shí)，其有效芽個(gè)數(shù)達(dá)到了最大值，隨后下降；當(dāng)TDZ的濃度在1.0 mg/L時(shí)，TDZ兩種添加方式影響下的有效芽數(shù)基本持平；當(dāng)TDZ的濃度在0.4～1.0 mg/L時(shí)，添加了TDZ的各處理的有效芽數(shù)均顯著（P＜0.05）高于對(duì)照（不添加TDZ）。而以另一種方式添加TDZ后，當(dāng)TDZ的濃度高于0.8 mg/L時(shí)，其有效芽數(shù)才顯著（P＜0.05）高于對(duì)照。

2.2 不同濃度的TDZ對(duì)兔耳風(fēng)不定芽增殖及髙生長的影響

圖2 TDZ的添加方式對(duì)組培苗有效芽數(shù)及苗高的影響Fig. 2 Effect of added ways of TDZ on effective bud number and seedling height in tissue culture seedlings

不同濃度的TDZ對(duì)兔耳風(fēng)不定芽增殖及苗髙生長的影響情況如表2。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著在同一培養(yǎng)基中的繼續(xù)培養(yǎng)，不同濃度的TDZ處理的不定芽增殖系數(shù)及苗髙生長均發(fā)生了明顯的變化，繼代第3次的增殖生長已趨于穩(wěn)定狀態(tài)，因此，本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的是繼代3次后的結(jié)果。表2表明，不同濃度TDZ處理的增殖系數(shù)在3.67～5.11之間，均顯著高于對(duì)照，比對(duì)照提高了1.38～1.92倍。隨著TDZ濃度的增加，其增殖系數(shù)呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，增殖系數(shù)最高達(dá)到了5.11，顯著高于TDZ濃度分別為0.2、0.4、0.6和1.0 mg/L的各處理。

表2 不同濃度的TDZ對(duì)兔耳風(fēng)不定芽增殖及苗髙生長的影響?Table 2 Effect of different concentrations of TDZ on adventitious bud proliferation and seedling height in A. fragrans

隨著TDZ濃度的增加，雖然總芽數(shù)和苗高呈升高趨勢(shì)，但是有效芽數(shù)及其所占總芽數(shù)的比率在達(dá)到一個(gè)峰值后，又有略微下降的趨勢(shì)。從芽的質(zhì)量狀況來看，當(dāng)TDZ的濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，苗高達(dá)到了2.84 cm，但植株莖干細(xì)弱，葉卷曲，苗木呈玻璃化狀。綜合來看，TDZ濃度在0.8 mg/L時(shí)，其苗高雖然比濃度為1.0 mg/L的TDZ處理的低，但其增殖系數(shù)、有效芽數(shù)均達(dá)到了最大值，其主莖粗壯，葉色濃綠，植株健壯，苗質(zhì)量總體達(dá)到最優(yōu)，使已經(jīng)嚴(yán)重退化的試管苗又恢復(fù)了正常的增殖生長能力，達(dá)到了預(yù)期的復(fù)壯效果。

2.3 不同濃度的NAA和IBA對(duì)兔耳風(fēng)組培苗生根的影響

以1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，分別選取健壯、苗高＞1 cm并在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L＋TDZ 0.8 mg/L培養(yǎng)基（以下簡稱TDZ）上連續(xù)培養(yǎng)3代以上的試管苗和在MS＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基（以下簡稱TDZ0）上獲得的試管苗進(jìn)行生根試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

根的質(zhì)量是影響組培苗移栽成活率的關(guān)鍵因素之一。試驗(yàn)中選用生根率、根長及根數(shù)這3個(gè)指標(biāo)來評(píng)價(jià)杏香兔耳風(fēng)根的質(zhì)量，同時(shí)采用排隊(duì)評(píng)分法，將多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為單指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繼而確定各項(xiàng)指標(biāo)的優(yōu)劣度和重要性。按生根率排隊(duì)，4號(hào)試驗(yàn)為70%，排在最后，計(jì)1分；3號(hào)試驗(yàn)為97%，最高，計(jì)10分；其他試驗(yàn)號(hào)各指標(biāo)值的得分視其與該指標(biāo)最優(yōu)值的差異按比例計(jì)分，將每號(hào)試驗(yàn)的所有指標(biāo)的分?jǐn)?shù)相加即得綜合評(píng)分，如表4所示。由表4可知，2號(hào)試驗(yàn)的綜合評(píng)分最高，即試驗(yàn)條件為A1B2C2，影響因素的主次順序?yàn)镃、B、A，較佳試驗(yàn)處理為A2B1C2?？梢姡珹因素的影響最小，即TDZ處理對(duì)組培苗生根的影響不大。由此得出，最優(yōu)的生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS＋NAA 0.02 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of the orthogonal test

表4 各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)的排隊(duì)評(píng)分結(jié)果和極差分析結(jié)果Table 4 Result of scoring and range analysis of each tested index

3 結(jié)論與討論

有關(guān)研究結(jié)果表明，TDZ用于西南樺[8]、桑樹[9]、黑荊樹[10]等組織培養(yǎng)中均可誘導(dǎo)芽的發(fā)生和增殖。本研究結(jié)果表明，在杏香兔耳風(fēng)組織培養(yǎng)過程中，TDZ的添加對(duì)其不定芽的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，并且同其他植物生長調(diào)節(jié)劑一樣，具有一定的作用范圍，這種低質(zhì)量濃度處理可促進(jìn)生長而高質(zhì)量濃度處理卻抑制生長的特性產(chǎn)生的原因可能是，外植體內(nèi)部的內(nèi)源激素與TDZ在低濃度時(shí)維持著一定的平衡狀態(tài)，而高濃度處理打破了二者的平衡，從而抑制其生長[11]。TDZ細(xì)胞分裂素活性強(qiáng)于6-BA，最高的增殖系數(shù)達(dá)到了5.11，要高于江香梅等人[5]研究的結(jié)果（5.05），此時(shí)組培苗的葉綠、大且伸展，苗粗壯，組培苗的質(zhì)量要優(yōu)于江香梅等人單獨(dú)使用6-BA培育的苗木質(zhì)量，這也說明了TDZ與6-BA有很好的協(xié)同促進(jìn)作用，這與陳宗禮等人[12]對(duì)棗樹的研究結(jié)果一致，其作用機(jī)理可能與TDZ可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的生物合成，抑制內(nèi)源生長素的降解有關(guān)[13]。在含有TDZ的培養(yǎng)基中，已衰退的組培苗的增殖能力又重新得到了恢復(fù)，表現(xiàn)出了良好的生長態(tài)勢(shì)；在香椿的組培快繁中也有同樣的研究報(bào)道[14]。這可能與TDZ處理引起了植物組織和器官內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)的改變，延緩了離體葉片的葉綠素降解速度[15]，改變了細(xì)胞膜的透性[16]等有關(guān)，從而提高了組培苗增殖能力，改善了組培苗的質(zhì)量。但是，TDZ的不同添加方式對(duì)杏香兔耳風(fēng)增殖的適宜濃度范圍的影響有差異，這可能與高壓滅菌影響了TDZ的活性有關(guān)。有關(guān)研究結(jié)果表明，TDZ的活性取決于其特殊結(jié)構(gòu)，如果其結(jié)構(gòu)被改變則其活性會(huì)降低[2]，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TDZ經(jīng)高壓滅菌后其活性低于抽濾滅菌方式的，這可能因?yàn)楦邷馗邏簻缇谝欢ǔ潭壬掀茐牧薚DZ的分子結(jié)構(gòu)，但具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

不定芽的數(shù)量及高度均影響苗木的生根。許多研究結(jié)果都表明，低質(zhì)量濃度的TDZ可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的叢生芽，且能促進(jìn)芽的伸長；高質(zhì)量濃度的TDZ雖能產(chǎn)生大量的不定芽，但會(huì)抑制組培苗的伸長生長[10，17]。本研究結(jié)果表明，TDZ亦能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的不定芽，但是有效芽的個(gè)數(shù)有所減少，且組培苗莖干纖弱，不利于后期生根。

TDZ對(duì)組培苗生根的影響因物種不同而有不同的生理效應(yīng)，其用于棉花、芋等離體芽培養(yǎng)中有促進(jìn)生根的作用[18-19]，而其對(duì)樹莓、棗樹和香椿等組培苗的生根卻有抑制作用[12,14,20]，仙客來在含有TDZ的培養(yǎng)基中亦不能生根[21]。本研究結(jié)果表明，在增殖培養(yǎng)基中添加TDZ，對(duì)后期組培苗生根的影響不大，這與其在香椿中的試驗(yàn)效果一致，但其對(duì)組培苗生根的影響情況還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)加以證實(shí)。

[1]Arndt F, Rusch R, Stilfried H V. A new cotton defoliant[J]. Plant Physiology, 1976, 57: 99－104.

[2]Mok M C, Mok D WS, Armsstrong D J,et al.Cytokin activrity of TDZ (thidiazuron) [J]. Phytochemistry, 1982,21:1509－1511.

[3]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志:第七十九卷[M].北京:科學(xué)出版社,1996:31－33.

[4]王 彪,何立德.新型植物生長調(diào)節(jié)劑噻苯隆機(jī)理作用及應(yīng)用[J].新疆農(nóng)墾科技,2011,(2):63－64.

[5]江香梅,戴小英,黃麗莉.杏香兔耳風(fēng)組培快繁技術(shù)[J].江西林業(yè)科技,2006,(5):24－26.

[6]龍祥友,賀定翔,郭德美,等.杏香兔耳風(fēng)的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43 (1):134.

[7]戴小英,于 宏,江香梅.杏香兔耳風(fēng)葉外植體組培高效繁育體系建立[J],江西林業(yè)科技,2008,(6):23－24.

[8]朱昌叁,龐正轟,馮立新,等.TDZ對(duì)西南樺組織培養(yǎng)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,(22):70－74.

[9]王旭煒,付 杰,王 青,等.TDZ在木本植物再生中的應(yīng)用趨勢(shì)及桑樹中的前景[J].蠶學(xué)通訊,2014,34(1):22－29.

[10]唐佳佳,尚旭嵐,洑香香.黑荊樹愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(9):38－43.

[11]Letham D S. Phytohormones in retrospects[M].New York:Plencem Press,1987,7(1):1－27.

[12]陳宗禮,齊向英,張向前,等.TDZ和6-BA對(duì)棗樹繼代培養(yǎng)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2006,15(3):162－165.

[13]Thomas J C, Katterman F R. Cytokinin activity induced by thidiazuron[J]. Plant Physiol, 1986,81:681－683.

[14]張小紅,張紅燕,武 軍,等,TDZ對(duì)香椿愈傷組織誘導(dǎo)及芽增殖生長等的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2002, 30(5):35－39.

[15]Visser C, Eleteher R A, Saxena P K. TDZ stimulates expansion and greening in cucumber cotyledons[J].Physici Mil Biol Plants,1995, (1):21－26.

[16]吳緒東,謝清忠,王彥文,等.噻二唑苯基脲(TDZ)對(duì)離體培養(yǎng)桑樹葉片的抗老化能力影響[J].蠶業(yè)科學(xué),2010,36(4):0667－0670.

[17]劉 淼,曹后男,宗成文,等.TDZ對(duì)牛皮杜鵑葉片分化及繼代增殖的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,21(12):158－162.

[18]張寶紅,李秀蘭.TDZ在棉花組織培養(yǎng)中的效應(yīng)研究[J].作物學(xué)報(bào),1995,3(21～22):254－256.

[19]崔 瑾,朱月林,李式軍.苯基噻二唑基脲（TDZ）在不同基因型芋組織培養(yǎng)中的生理效應(yīng)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,25(2): 31－34.

[20]張宗勤,董麗芬,張 波,等.TDZ對(duì)樹莓微繁殖的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2004,22(4):50－52.

[21]周連霞,馬鋒旺,陳登文,等.TDZ對(duì)仙客來不同外植體再生的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,34(4):39－42.

Effects of TDZ on rejuvenation of tissue culture seedlings inAinsliaea fragrans

LI Feng-qing, YAO Jia-bao, ZENG Man-sheng, LI Yue-qiao, YUAN Ya-qi, ZHOU Xin-hua
(Experimental Center of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Fenyi 336600, Jiangxi, China)

In order to learn effects of TDZ on proliferation of tissue culture seedlings, the function of TDZ during rejuvenation of declining tissue culture seedlings were researched, taking declining tissue culture seedlings inAinsliaea fragransas materials. The effects of TDZ added ways (leaching sterilization and high-pressure sterilization) and TDZ concentrations (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/L) on proliferation coefficient, effective bud number and seedling height were researched. The results showed that TDZ added ways had bigger effects on proliferation coefficient and effective bud number when TDZ concentration was over 0.2 mg/L, and proliferation coefficient and effective bud number in the leaching sterilization treatment were obviously higher than those in the high-pressure sterilization treatment. The effects of different concentrations of TDZ on effective bud number and seedling height had significant differences (P＜0.01).When TDZ concentration was 0.8 mg/L, the seedlings had the best quality, proliferation coefficient was 5.11, and the expectant rejuvenation effect was obtained. The optimal rooting medium was 1/2MS+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.1 mg/L. In the rejuvenation process of tissue culture seedlings inA. fragrans, TDZ could be used as an effective plant growth regulator.

Ainsliaea fragransChamp; TDZ; tissue culture; proliferation; rejuvenation

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.03.020 http: //qks.csuft.edu.cn

2014-08-18

中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（CAFYBB2012002）。

李峰卿，工程師，博士研究生。E-mail：lfqnjfu@163.com

李峰卿,姚甲寶,曾滿生,等. TDZ對(duì)杏香兔耳風(fēng)組培苗復(fù)壯的影響[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(3):112－115,125.

S603

A

1003—8981(2015)03—0112—04

[本文編校：伍敏濤]