劉蓄瑾，胡志和*，劉軍軍，邸紅艷，張 莉，孫 源，朱麗萍

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

超高壓殺滅青蛤污染弧菌條件優(yōu)化

劉蓄瑾，胡志和*，劉軍軍，邸紅艷，張 莉，孫 源，朱麗萍

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134）

以青蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，以水產(chǎn)品常見(jiàn)污染的致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CGMCC1.1997及溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）CGMC1.1833為目標(biāo)菌，優(yōu)化超高壓殺菌條件。研究選用CGMCC1.1997和CGMC1.1833兩種弧菌菌株，在離體和在體狀態(tài)下，采用不同壓力、保壓溫度及時(shí)間進(jìn)行處理，確定殺滅條件。結(jié)果表明，在離體狀態(tài)下，300 MPa、20 ℃處理5 min或不小于300 MPa、30 ℃ 處理3 min以上，可以徹底殺滅108CFU/mL的弧菌；但在體狀態(tài)下，即使青蛤污染的弧菌量級(jí)為104CFU/g，該條件仍不能徹底殺滅所污染的弧菌，說(shuō)明青蛤的肌肉組織對(duì)弧菌的殺滅有保護(hù)作用。經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到超高壓殺滅青蛤中弧菌（污染菌的量級(jí)為104CFU/g）的條件為500 MPa、30 min、30 ℃或400 MPa、30 min、40 ℃或600 MPa、20 min、40 ℃，這些條件下，同樣可殺滅青蛤體內(nèi)污染更高數(shù)量級(jí)（107CFU/g）弧菌，說(shuō)明青蛤肌肉組織對(duì)高壓殺滅弧菌的保護(hù)作用是有限度的。因此，超高壓處理可以殺滅青蛤污染的弧菌；在一定壓力條件下，青蛤的肌肉組織對(duì)弧菌的殺滅有保護(hù)作用，但其保護(hù)作用是有限度的。

青蛤；副溶血弧菌；溶藻弧菌；超高壓

青蛤（Cylcina sinensis）俗稱(chēng)蛤蜊，在我國(guó)各沿海地區(qū)均有分布。青蛤中豐富的氨基酸及多不飽和脂肪酸使其具有預(yù)防疾病及保健作用[1-3]，潛海生存的習(xí)性使其具有咸、寒的藥性，是滋陰清熱的良藥[4-5]。青蛤中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)含量高[6-7]，新鮮青蛤有“天下第二鮮的美譽(yù)”。貝類(lèi)因?yàn)V食的攝食方式，極易受到水環(huán)境中致病菌及病毒的侵害并在體內(nèi)蓄積，食用加工不當(dāng)?shù)呢愵?lèi)易造成安全性問(wèn)題。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)表明，副溶血弧菌引發(fā)的食物中毒規(guī)模出現(xiàn)明顯上升，危害僅次于沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、葡萄球菌和肉毒梭菌[8-9]。

近年來(lái)，為了“鮮上加鮮”的味覺(jué)享受及柔嫩的口感，以及對(duì)原汁味、高營(yíng)養(yǎng)的訴求，更多人選擇生食，這為寄生蟲(chóng)及致病菌對(duì)人類(lèi)的感染埋下隱患。超高壓處理作為一種冷加工技術(shù)，既可以起到殺菌的效果，又能很好地保持食品固有的色澤、口感、營(yíng)養(yǎng)、新鮮程度等，對(duì)食品的風(fēng)味、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)沒(méi)有破壞作用[10]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)青蛤容易污染的兩種嗜鹽性致病 菌：副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyt icus），利用超高壓處理，研究不同壓力、時(shí)間和溫度對(duì)兩種弧菌的殺滅條件，比較兩種弧菌在離體狀態(tài)與在貝類(lèi)體內(nèi)（在體狀態(tài)）對(duì)壓力耐受性的差異，為研究高壓處理青蛤的食用安全性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

青蛤（Cylcina sinensis） 天津韓家墅水產(chǎn)品市場(chǎng)。

CGMCC1.1997 Vibrio parahaemolyticus、CGMC1.1833 Vibrio alginolyticus 中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂、3%氯化鈉堿性蛋白胨水（3% NaCl alkaline peptone water，3% N-APW）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

氯化鈉、丙三醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L3-800/2.5超高壓設(shè)備 華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽（控制超高壓處理的溫度） 寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA25-18G實(shí)驗(yàn)室高切分散乳化機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；HS-50立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HFsafe-900生物安全柜 上海力申科學(xué)儀器有限公司；SW-GT-1F超凈工作臺(tái) 上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司；CLIN-250生化培養(yǎng)箱 天津華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TCC-240A紫外分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；20菌落計(jì)數(shù)器 意大利Astor Tecnica公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及保存

菌種活化：無(wú)菌操作吸取0.5 mL 3% N-APW，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈均勻地懸浮狀。將全部菌液移入5 mL 3% N-APW中，（36±1） ℃培養(yǎng)24～48 h，觀(guān)察菌液是否混濁，若無(wú)混濁增加一倍培養(yǎng)時(shí)間。至菌液混濁，無(wú)菌操作用接種環(huán)挑取菌液進(jìn)行斜面接種，37℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行二次接種。將斜面培養(yǎng)基4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

甘油管凍存：待菌種復(fù)壯，無(wú)菌操作用接種環(huán)挑取菌液接種至5 mL 3% N-APW中增菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，移取適量菌液于EP管中，加滅菌甘油調(diào)節(jié)終濃度至20%～30%，4 ℃預(yù)冷后于－80 ℃凍存。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

取活化后的菌液接入3% N-APW增菌液中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定初始菌液600 nm波長(zhǎng)處光密度值（3% N-APW做空白對(duì)照），后置于37℃搖床160 r/min培養(yǎng)24 h，每隔1 h測(cè)定菌液吸光度（每組3 個(gè)平行），繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

致死率和存活率計(jì)算見(jiàn)公式（1）和（2）。

1.3.3 超高壓處理

1.3.3.1 超高壓處理對(duì)弧菌的影響

取活化后菌種增菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用3% N-APW調(diào)整菌濃至108、107、106、105、104CFU/mL分裝于10 mL無(wú)菌袋中真空密封包裝后，于不同壓力（100～350 MPa）、保壓溫度（20～50 ℃）、保壓時(shí)間（1～5 min）進(jìn)行處理，研究壓力、溫度和保壓時(shí)間對(duì)兩種弧菌存活的影響，每組樣品重復(fù)3 次。

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化超高壓殺滅副溶血弧菌/溶藻弧菌的條件。

1.3.3.2 超高壓處理對(duì)青蛤中弧菌及菌落總數(shù)的影響

將新鮮青蛤用無(wú)菌水清洗表面，挑選大小均勻的8 個(gè)為一組，分裝于無(wú)菌袋中，加無(wú)菌水浸沒(méi)后真空密封包裝后，再不同壓力（300～700 MPa）、保壓溫度（20～50 ℃）、保壓時(shí)間（5～40 min）條件下進(jìn)行處理，研究對(duì)青蛤中弧菌的影響，每組樣品重復(fù)3 次。

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化超高壓殺滅青蛤中微生物的條件。

1.3.4 微生物的測(cè)定

根據(jù)GB 4789.7—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：副溶血弧菌檢驗(yàn)》[11]檢測(cè)超高壓后的菌液/貝肉勻漿液中弧菌。10 倍梯度稀釋?zhuān)? mL樣液于培養(yǎng)皿中；3%氯化鈉-胰蛋白胨大豆瓊脂傾倒平板，每組樣品2 個(gè)平行；置于37 ℃培養(yǎng)24 h；平板菌落計(jì)數(shù)，取平均值。

根據(jù)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：菌落總數(shù)測(cè)定》[12]檢測(cè)菌落總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將每組菌落計(jì)數(shù)得到的平均值轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值，用SPSS 16.0進(jìn)行多重比較分析及顯著性分析，比較不同處理?xiàng)l件對(duì)弧菌存活量的影響及離體與在體狀態(tài)下弧菌對(duì)超高壓耐受性的差異；圖表制作利用Origin 8軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落數(shù)與OD值關(guān)系曲線(xiàn)

無(wú)菌操作取活化后菌液，調(diào)整菌濃約108CFU/mL作為初始菌液，用3% N-APW分別稀釋1.5、2、2.5、3、4、5 倍后迅速測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處OD值，并根據(jù)GB 4789.7—2013平板菌落計(jì)數(shù)。得到菌落數(shù)取對(duì)數(shù)值，與OD值對(duì)應(yīng)，擬合出菌濃與OD值關(guān)系曲線(xiàn)（圖1），y=0.738 2x＋7.755 9。實(shí)驗(yàn)用3% N-APW 為空白對(duì)照。

圖1 菌落數(shù)與OD值關(guān)系曲線(xiàn)Fig.1 Relationship curve between number of colonies and OD value

2.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖2 弧菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.2 Growth curves of Vibrio

由圖2可知，兩種弧菌在4～10 h內(nèi)呈現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，10～16 h為相對(duì)穩(wěn)定期，18 h之后逐漸衰亡。指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞群體增長(zhǎng)活躍且代謝旺盛，能較好地反映細(xì)胞性能。超高壓處理中選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的菌液，用3% N-APW調(diào)整菌濃至108CFU/mL并梯度稀釋得到107、 106、105、104CFU/mL，研究超高壓對(duì)不同濃度的副溶血弧菌及溶藻弧菌的影響。

2.3 超高壓處理對(duì)弧菌的影響

2.3.1 時(shí)間對(duì)不同濃度弧菌的影響

不同濃度的菌液在20 ℃、200 MPa壓力下處理不同時(shí)間，結(jié)果如圖3所示。

圖3 200 MPa、20 ℃條件下不同時(shí)間處理對(duì)弧菌存活量的影響Fig.3 Effect of UHP at 200 MPa and 20 ℃ on Vibrio survival

由圖3可知，隨著保壓時(shí)間由1 min延長(zhǎng)到5 min，溶藻弧菌和副溶血弧菌存活量均有所降低。初始菌濃為108～104CFU/mL的溶藻弧菌，在200 MPa、20℃處理1min后存活率分別為53.28%、33.82%、39.69%、17.7%、7.38%，而5 min處理后分別降至9.43%、0.74%、0.18%、0.31%、0.16%。菌濃為108CFU/mL的副溶血弧菌處理5 min存活率時(shí)僅為0.65%。超高壓處理隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)弧菌存活量削減效果明顯。

由圖3中弧菌存活量變化趨勢(shì)來(lái)看，兩種弧菌存活率的下降趨勢(shì)均較平穩(wěn)，在5 min時(shí)存活量達(dá)到較低水平，但與3、4 min處相比均差異顯著，因此選取3、4、5 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 壓力對(duì)不同濃度弧菌的影響

不同濃度的菌液在20 ℃不同壓力下處理3 min，結(jié)果如圖4所示。隨壓力增大，溶藻弧菌和副溶血弧菌存活量都明顯減少。150 MPa時(shí)，菌濃為108～104CFU/mL的溶藻弧菌存活率分別為72.69%、51.96%、36.92%、34.36%、35.11%；250 MPa時(shí)，菌濃為108CFU/mL的溶藻弧菌存活率僅為1.77%，107～104CFU/mL的溶藻弧菌存活率均在0.01%以下；300 MPa時(shí)，菌濃為107～104CFU/mL的溶藻弧菌存活率均為0，而108CFU/mL的溶藻弧菌無(wú)法徹底殺滅；壓力達(dá)到350 MPa時(shí)，108～104CFU/mL的溶藻弧菌均可被徹底殺滅。300 MPa時(shí)108和107CFU/mL的副溶血弧菌無(wú)法徹底殺滅，此時(shí)106～104CFU/mL的副溶血弧菌存活率均為0；當(dāng)壓力為350 MPa時(shí)，108～104CFU/mL的副溶血弧菌均可被徹底殺滅。

200 MPa以上壓力處理對(duì)弧菌起到很好的削減效果，壓力為300 MPa時(shí)菌濃低于106CFU/mL的弧菌可被殺滅，達(dá)到350 MPa時(shí)108CFU/mL的弧菌均可被殺死。因此，選取200、250、300 MPa進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 20 ℃、3 min條件下不同壓力處理對(duì)弧菌存活量的影響Fig.4 Effect of UHP at 20 ℃ and different pressures for 3 min on Vibrio survival

2.3.3 溫度對(duì)不同濃度弧菌的影響

不同濃度的菌液在不同溫度條件下，300 MPa壓力處理3 min，結(jié)果如圖5所示。隨著溫度的升高，弧菌存活量逐漸減少。20 ℃時(shí)108～104CFU/mL的溶藻弧菌存活率分別為29.02%、2.67%、2.44%、2.58%、2.26%；當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，不同菌濃溶藻弧菌和副溶血弧菌存活率均已不足0.1%，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，菌濃在107CFU/mL以下的溶藻弧菌存活量為0，此時(shí)菌濃在106CFU/mL以下的副溶血弧菌均可被徹底殺滅。

由此看出弧菌溫度耐受性較差。有研究[13]指出，副溶血弧菌在55 ℃、10 min即可殺滅。

為驗(yàn)證弧菌在50 ℃是耐受性，將活化后菌液調(diào)整菌濃為108CFU/mL，取10 mL于無(wú)菌袋中真空密封分裝16 份，置于50 ℃水浴鍋中水浴，在0、3、5、 7、9、11、13、15 min時(shí)分別取出2 份（平行），平板菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，弧菌在50 ℃環(huán)境中隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，存活量逐漸降低，13 min時(shí)兩種菌都無(wú)法檢出。綜上，選取20、30、40 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 200 MPa、3 min條件下不同溫度處理對(duì)弧菌存活量的影響Fig.5 Effect of UHP at 200 MPa and different temperatures for 3 min on Vibrio survival

圖6 弧菌50 ℃耐受性Fig.6 Survival rates of Vibrio at 50 ℃

2.3.4 超高壓殺滅弧菌條件的優(yōu)化

由單因素試驗(yàn)結(jié)果選取出壓力（200、250、 300 MPa）、溫度（20、30、40 ℃）、時(shí)間（3、4、5 min）進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化殺滅弧菌的條件，選取菌液濃度為108CFU/mL的副溶血弧菌和溶藻弧菌。

由表1分析k值得到溶藻弧菌最優(yōu)組合為A3B3C3（300 MPa、40 ℃、5 min），經(jīng)驗(yàn)證，該條件下溶藻弧菌致死率為100%；分析副溶血弧菌的k’值可知A1＜A2＜A3，而B(niǎo)1＜B2=B3，C1＜C2=C3，經(jīng)驗(yàn)證當(dāng)壓力為A3水平時(shí)，A3B2C2（300 MPa、30 ℃、4 min）、A3B2C3（300 MPa、30 ℃、5 min）、A3B3C2（300 MPa、 40 ℃、4 min）和A3B3C3（300 MPa、40 ℃、5 min）均可將副溶血弧菌徹底殺死。

表1 弧菌殺滅條件優(yōu)化結(jié)果L9（34）Table1 Orthogonal array design L9((34) with experimental results of Vibrio mortality

由副溶血弧菌和溶藻弧菌致死率的相關(guān)數(shù)據(jù)，在條件A3B1C3（300 MPa、20 ℃、5 min）、A3B2C1（300 MPa、30 ℃、3 min）和A3B3C2（300 MPa、40 ℃、4 min）時(shí)，副溶血弧菌和溶藻弧菌致死率均可達(dá)到100%。

綜上，壓力為300 MPa時(shí)，20 ℃處理5 min或保壓溫度不小于30 ℃，保壓時(shí)間不小于3 min均可以徹底殺滅副溶血弧菌和溶藻弧菌，說(shuō)明超高壓結(jié)合溫度處理可以徹底殺滅溶藻弧菌和副溶血弧菌。

2.4 在體狀態(tài)下青蛤污染弧菌的殺滅條件確定

2.4.1 徹底殺滅離體狀態(tài)下弧菌條件作用于青蛤的實(shí)驗(yàn)

將2.3.4節(jié)優(yōu)化的殺菌條件，用于青蛤中弧菌的殺滅，其結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)中購(gòu)買(mǎi)的市售青蛤弧菌數(shù)約104CFU/mL（經(jīng)TCBS培養(yǎng)基劃線(xiàn)培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)與弧菌純菌種相同，鏡檢形態(tài)一致），將篩選出的離體弧菌殺菌條件作用于青蛤，驗(yàn)證是否可以同樣殺滅青蛤中的弧菌。

表2 離體狀態(tài)下殺滅弧菌條件作用于青蛤的結(jié)果Table2 Comparison of in vitro sterilization effifi ciencies of Vibrio from Cylcina sinensis by different UHP treatments %

由表2結(jié)果可以看出，在離體狀態(tài)下，菌液濃度為108CFU/mL的菌液徹底殺滅弧菌的條件，用于青蛤的殺菌，即使污染菌液濃度只有104CFU/g，也不能徹底殺滅所污染的弧菌。將處理時(shí)間延長(zhǎng)至5 min仍無(wú)法徹底殺滅所污染的弧菌。因此說(shuō)明，在體狀態(tài)下，采用超高壓殺菌時(shí)，青蛤的肌肉組織對(duì)污染的微生物有保護(hù)作用。

另外，研究[14]表明，副溶血弧菌代時(shí)較短約8～10 min，若條件適宜，殘留在青蛤體內(nèi)的弧菌可能快速增殖至中度劑量，誘發(fā)食物中毒。為了食用安全，必須將青蛤中的微生物全部殺滅。

2.4.2 時(shí)間對(duì)青蛤中微生物的影響

圖7 300 MPa、20 ℃條件下不同時(shí)間處理對(duì)青蛤中微生物存活量的影響Fig.7 Effect of UHP at 300 MPa and 20 ℃ for different periods of time on Vibrio survival in Cylcina sinensis

如圖7所示，300 MPa壓力處理5 min青蛤中弧菌及其他微生物的致死率均為98.61%，30 min時(shí)弧菌及其他微生物的致死率分別為99.45%和99.73%，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至40 min時(shí)弧菌及其他微生物的致死率率分別為99.76%和99.90%。因此，選擇10、20、30 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.3 壓力對(duì)青蛤中微生物的影響

圖8 20 ℃條件下不同壓力處理5 min對(duì)青蛤中微生物存活量的影響Fig.8 Effect of UHP pressure at 20 ℃ for 5 min on Vibrio survival in Cylcina sinensis

20 ℃不同壓力處理5 min對(duì)青蛤中微生物的影響，結(jié)果如圖8所示。隨壓力變化，青蛤中微生物表現(xiàn)出對(duì)壓力敏感性，300 MPa壓力處理5 min時(shí)弧菌致死率可達(dá)98.61%，其他微生物致死率98.59%，隨著壓力增大，致死率顯著升高，700 MPa時(shí)，弧菌及其他微生物致死率可達(dá)99.93%及99.94%，僅有微量存活。同時(shí)考慮到處理后青蛤的口感，選擇400、500、600 MPa進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.4 溫度對(duì)青蛤中微生物的影響

圖9 300 MPa、5 min條件下不同溫度處理對(duì)青蛤中微生物存活量的影響Fig.9 Effect of UHP treatment time at 200 MPa for 5 min on Vibrio survival in Cylcina sinensis

不同溫度條件下300 MPa處理5 min對(duì)青蛤中微生物的影響，結(jié)果如圖9所示。隨著溫度的升高，弧菌及其他微生物存活量逐漸減少，各溫度對(duì)青蛤中弧菌及其他微生物影響均顯著，20 ℃時(shí)致死率已達(dá)90%以上；40 ℃時(shí)弧菌及其他微生物致死率分別達(dá)到99.45%和99.16%；50℃時(shí)可達(dá)到99.71%和99.49%。因此，選取20、30、40 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4.5 超高壓殺滅青蛤中微生物條件的優(yōu)化

表3 青蛤中微生物殺菌條件優(yōu)化結(jié)果L9（34)Table3 Orthogonal array design L9(34) with experimental results of Cylcina sinensis sterilization

由表3 可知，k值和k’值分析弧菌及其他微生物致死率的最優(yōu)組合為A3B3C3（40 ℃、600 MPa、30 min），經(jīng)驗(yàn)證，在該條件下青蛤中的弧菌及其他微生物均可被徹底殺滅；由表3中弧菌及其他微生物致死率結(jié)果可知，在A2B2C3（30 ℃、500 MPa、30 min）、A3B1C3（40 ℃、400 MPa、30 min）、A3B3C2（40 ℃、600 MPa、20 min）條件下，弧菌和其他微生物的致死率為100%。

綜上，正交試驗(yàn)優(yōu)化得到徹底殺滅青蛤中弧菌及其他微生物的條件為500 MPa、30 ℃、30 min， 400 MPa、 40 ℃、30 min和600 MPa、40 ℃、20 min。

2.4.6 青蛤活體接種弧菌驗(yàn)證殺菌條件

由表3已確定出青蛤徹底殺菌的條件，實(shí)驗(yàn)所用青蛤攜帶弧菌數(shù)約104CFU/g。重度污染的水域貝類(lèi)最高攜帶弧菌可達(dá)106CFU/g，為確保食用安全，實(shí)驗(yàn)中采取對(duì)活體青蛤人工接種副溶血弧菌和溶藻弧菌，接種方法參照趙峰等[15]。將菌種活化后于3% N-APW中，37 ℃搖床（140 r/min）培養(yǎng)，調(diào)整菌濃至108CFU/mL，按1∶100的比例接種到滅菌海水中（每升海水接種10 個(gè)青蛤），平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)定接種后海水及接種前青蛤體內(nèi)弧菌含量，置于24 ℃恒溫環(huán)境中培養(yǎng)24 h，24 h后分別測(cè)定海水中及青蛤體內(nèi)弧菌含量；并對(duì)青蛤進(jìn)行超高壓處理，驗(yàn)證上述殺菌條件能否殺滅青蛤中更大濃度的弧菌。實(shí)驗(yàn)中副溶血弧菌和溶藻弧菌兩種菌分別接種，培養(yǎng)后青蛤內(nèi)污染的菌液濃度見(jiàn)表4。

表4 青蛤活體接種弧菌Table4 Growth of Vibrio inoculated to living Cylcina sinensis

接種量及培養(yǎng)24 h后海水中弧菌含量均為106CFU/mL但數(shù)量有所增加，接種副溶血弧菌的青蛤中弧菌含量由104CFU/g 增加到107CFU/g；接種溶藻弧菌的青蛤中弧菌含量由104CFU/g 增加到106CFU/g，說(shuō)明弧菌在海水和青蛤體內(nèi)菌發(fā)生增殖，并在青蛤體內(nèi)富集。將2.4.5節(jié)所確定的在體狀態(tài)下殺菌條件，用于更高污染菌的環(huán)境中的青蛤殺菌，結(jié)果見(jiàn)表5。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，即使青蛤體內(nèi)弧菌含量高達(dá)107CFU/g，篩選出的殺菌條件仍然能夠?qū)⑽廴镜幕【推渌⑸飶氐讱?。說(shuō)明在高壓條件下進(jìn)行殺菌，青蛤組織成分對(duì)污染的微生物有保護(hù)作用，但是這種保護(hù)作用是有限度的。

表5 活體接種青蛤驗(yàn)證殺菌條件Table5 Verififi cation of sterilization conditions for living Cylcina sinensis inoculated with Vibrio%

3 討 論

自20世紀(jì)以來(lái)，食品的安全性問(wèn)題日益凸現(xiàn)，各國(guó)逐步完善食品質(zhì)量安全市場(chǎng)準(zhǔn)入制度的同時(shí)，消費(fèi)者對(duì)原生態(tài)食品的需求增加，過(guò)度追求原汁原味而食用加工不徹底的貝類(lèi)，導(dǎo)致副溶血弧菌等引發(fā)食物中毒，各個(gè)年齡階段均有發(fā)病可能，在微生物性食物中毒病例中已經(jīng)高居首位[16-19]；簡(jiǎn)單的凈化處理很難將貝類(lèi)體內(nèi)的副溶血弧菌清除[20]；傳統(tǒng)的加熱蒸煮等方式，雖然起到良好的殺菌效果，但是伴隨著水分的流失、蛋白質(zhì)變性及質(zhì)構(gòu)特性的改變，失去了鮮嫩多汁的口感，同時(shí)造成營(yíng)養(yǎng)成分的損失。食品超高壓技術(shù)是逐步引起各國(guó)重視的一項(xiàng)熱點(diǎn)，更是食品工業(yè)領(lǐng)域具 有革命性的高新技術(shù)[21]。經(jīng)過(guò)超高壓處理，蛋白質(zhì)、糖、維生素、脂類(lèi)和色素的共價(jià)鍵對(duì)超高壓相對(duì)穩(wěn)定[22]，可以更好地保持食品風(fēng)味；食物中的蛋白質(zhì)、淀粉類(lèi)物質(zhì)超高壓處理后還可獲得新特性，延長(zhǎng)食品的保藏時(shí)間[23]。

超高壓對(duì)微生物的作用主要表現(xiàn)為對(duì)其細(xì)胞形態(tài)的損傷，從而影響生化反應(yīng)的進(jìn)行[24]，也會(huì)影響DNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制[25-26]。Ma等[27]按照104～105CFU/g的比例對(duì)牡蠣接種副溶血弧菌，并將接種后的牡蠣在（8±1）℃、293 MPa壓力下處理2 min，結(jié)果表明副溶血弧菌減少3.52（lg（CFU/g）），經(jīng)過(guò)該條件處理的牡蠣在冰中可儲(chǔ)存16～18 d，貨架期大大延長(zhǎng)。Phuvasate等[28]將副溶血弧菌接種到牡蠣組織勻漿中，施以250 MPa壓力5 min來(lái)比較幾種耐壓型菌株和壓力敏感性菌株在低溫環(huán)境下對(duì)壓力的耐受性，結(jié)果表明，5 ℃時(shí)不同株型檢出率約降低大于6～7（lg（CFU/g）），而1.5 ℃則降低到無(wú)法檢測(cè)的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超高壓結(jié)合溫度處理可以徹底殺滅貝中微生物，確保食用安全。

近年來(lái)，風(fēng)味水產(chǎn)品研究日益增多，超高壓處理即食貝類(lèi)將以其方便性、安全性及良好的口感廣泛被消費(fèi)者接受。超高壓殺菌用于水產(chǎn)品加工在國(guó)外已然進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)，近年我國(guó)自主研制的連續(xù)式超高壓設(shè)備最高處理壓力700 MPa，容量可達(dá)100 L以上，初步實(shí)現(xiàn)了設(shè)備工業(yè)化[29]，但由于我國(guó)對(duì)于超高壓食品產(chǎn)品質(zhì)量認(rèn)證評(píng)價(jià)體系的空白，距離商業(yè)化生產(chǎn)仍有一定距離[30]。

通過(guò)研究?jī)?yōu)化了離體和在體狀態(tài)下超高壓殺滅弧菌的條件，并進(jìn)行相互驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)超高壓可以徹底殺滅青蛤中所污染的弧菌和其他微生物，達(dá)到安全食用的目的。另外，在超高壓殺滅弧菌時(shí)，在一定條件下青蛤的肌肉組織成分對(duì)弧菌有保護(hù)作用，但這種保護(hù)作用是有限度的。

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Optimization of Sterilization Conditions for Vibrio in Cyclina sinensis Using Ultra-High Hydrostatic Pressure

LIU Xujin, HU Zhihe*, LIU Junjun, DI Hongyan, ZHANG Li, SUN Yuan, ZHU Liping
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The objective of this study was to optimize the conditions for killing Vibrio parahaemolyticus (Vp) CGMCC1.1997 and Vibrio alginolyticus (Va) CGMC1.1833 in Cyclina sinensis using ultra-high pressure (UHP). Both Vibrio species were treated in vitro and in vivo under different ultra-high pressure conditions including pressure, holding temperature and holding time. Results showed that under the in vitro condition, the two strains at an initial concentration of 108CFU/mL were completely killed by UHP treatment at 300 MPa and at 20 ℃ for 5 min or more than 3 min at 30 ℃. But the sterilization of Cyclina sinensis containing 108CFU/mL of Vibrio was incomplete suggesting the muscle tissue of Cyclina sinensis can protect against the inactivation of Vibrio by UHP treatment. The optimized UHP conditions for killing 108CFU/mL of Vibrio present in Cyclina sinensis were determined as follows: 500 MPa and 30 ℃ for 30 min, 400 MPa and 40 ℃ for 30 min, or 600 MPa and 40 ℃ for 20 min. Under these conditions, the quantity of Vibrio in Cyclina sinensis at a higher order of magnitude (107CFU/g) was inactivated consistently demonstrating that the muscle tissue of Cyclina sinensis can only provide limited protection on Vibrio. Therefore, Vibrio in contaminated Cyclina sinensis can be killed using ultrahigh pressure treatment, although its muscle tissue has only limited protective effects the bacteria.

Cylcina sinensis; Vibrio parahaemolyticus; Vibrio alginolyticus; ultra-high pressure

TS254.4

A

1002-6630（2015）20-0019-07

10.7506/spkx1002-6630-201520004

2015-06-01

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410069002）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（TD12-5049）

劉蓄瑾（1991 —），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：liuliuxujin@163.com

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)閷?zhuān)用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn