李紅衛(wèi)，王開萍，吳 娛，唐正江，湯 飛，劉國慶,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城 242000）

柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)

李紅衛(wèi)1，王開萍1，吳 娛1，唐正江1，湯 飛1，劉國慶1,2,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院，安徽 宣城 242000）

建立高效液相色譜法測定富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)的分析方法。采用6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解富硒米曲霉48 h，提取樣品中的有機(jī)硒，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯柱前衍生，C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，紫外檢測波長：240 nm，測得富硒米曲霉中有機(jī)硒化合物主要是硒代胱氨酸，檢出限（RSN=3）為0.680 mg/L，定量限（RSN=10）為2.244 mg/L，線性范圍為5.0～100 mg/L，加標(biāo)回收率為94.8%～105.8%，硒代胱氨酸的含量為1.25 mg/g。本方法簡單、靈敏、重復(fù)性好，可適用于富硒米曲霉及相關(guān)產(chǎn)品中有機(jī)硒形態(tài)的檢測分析。

富硒米曲霉；有機(jī)硒；硒代氨基酸；柱前衍生-反相高效液相色譜法

硒是人和許多生物體必需的微量元素，對生物體的健康具有重大意義。市面上出現(xiàn)了許多富硒產(chǎn)品，如酵母硒、植物硒以及一些富硒食用菌等，其品質(zhì)的高低不僅取決于硒的含量，還與硒的形態(tài)有著密切關(guān)聯(lián)。研究[1-2]表明：無機(jī)硒生物活性、利用率較低，不易被腸道吸收，還具有一定毒性，攝入過量會(huì)導(dǎo)致急性、慢性中毒；與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒是經(jīng)生物轉(zhuǎn)換而得，具有毒性小、生物利用度高的特點(diǎn)，并且硒的所有生物學(xué)功能均是通過硒蛋白來調(diào)控和實(shí)現(xiàn)的，因此有機(jī)硒相較于無機(jī)硒對生物體來說，更為重要。

米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用1 000多年。潘艷[3]利用米曲霉作為富硒載體，在其培養(yǎng)基中加入無機(jī)硒，利用生物轉(zhuǎn)化將難吸收的無機(jī)硒源轉(zhuǎn)化為易吸收的有機(jī)硒源[4]，發(fā)酵生產(chǎn)富硒米曲霉，測得搖瓶發(fā)酵的富硒量達(dá)2.512 mg/g，分批發(fā)酵的富硒量更是高達(dá)3.3 mg/g，遠(yuǎn)高于富硒酵母的1.0～2.0 mg/g硒含量?，F(xiàn)階段關(guān)于富硒酵母、植物硒和一些其他富硒產(chǎn)品中硒形態(tài)[5-7]的研究已經(jīng)較為完善，但富硒米曲霉中硒形態(tài)的研究這一領(lǐng)域仍然比較缺乏，因此建立一種分析富硒米曲霉中硒形態(tài)及含量的方法，不僅可以為該領(lǐng)域的研究提供一定的理論依據(jù)，也對評價(jià)其營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。與此同時(shí)，還能夠?qū)﹂_發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的富硒米曲霉保健品起促進(jìn)作用。

近些年來，國內(nèi)很多研究者對富硒樣品中硒的形態(tài)做了大量研究。陳尚衛(wèi)等[8]采用酶解提取法提取，氯甲酸乙酯衍生，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS-MS）聯(lián)用法選擇離子模式對富硒酵母中的硒代蛋氨酸進(jìn)行檢測；劉揚(yáng)等[9]采用蛋白酶提取富硒酵母中的有機(jī)硒，高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（high performance liquid chromatographyinductively coupled plasma mass spectrometry，HPLC-ΙCPMS）聯(lián)用法檢測其有機(jī)硒的形態(tài)；Deng Biyang等[10]采用稀酸提取，毛細(xì)管電泳-電化學(xué)發(fā)光（capillary electrophoresis coupled with electrochemiluminescence，CE-ECL）法檢測富硒酵母中硒代蛋氨酸；仲娜[11]采用微波消解法提取市場上出售的富硒大米、富硒茶葉、富硒螺旋藻、富硒大蔥、富硒雞蛋中的有機(jī)硒，HPLC-ΙCPMS測其硒形態(tài)。以上這些方法，HPLC-ΙCP-MS聯(lián)用儀器昂貴，普及度不高，樣品預(yù)處理繁瑣，分析成本較高；CE-ECL方法中電泳的重現(xiàn)性不高，影響定性定量結(jié)果?？紤]到以上這些因素，并且目前關(guān)于富硒米曲霉中硒形態(tài)的研究也較少，本實(shí)驗(yàn)針對其硒形態(tài)的分析建立一種方法，采用酸水解法進(jìn)行樣品提取，并用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯（4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride，CNBF）對樣品提取液進(jìn)行衍生，衍生過后直接運(yùn)用反相高效液相色譜法對樣品中的有機(jī)硒化合物形態(tài)和含量進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒米曲霉（硒含量2.325 mg/g） 實(shí)驗(yàn)室自制。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：硒代甲硫氨酸（SeMet，98%，CAS：3211-76-5）、硒代胱氨酸（SeCys2，97%，CAS：29621-88-3） 美國Sigma公司；衍生劑：CNBF 美國阿拉丁公司；超純水、pH 7.0磷酸緩沖液、pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液、pH 6.8乙酸-乙酸鈉（0.05 mol/L）緩沖液、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、0.08 mol/L NaOH、 6 mol/L HCl溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀配紫外檢測器 美國Waters公司；超微電子天平 德國Sartorius公司；SE812氮吹儀北京帥恩科技有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫水浴鍋國華電器有限公司；HC-3518型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型精度酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；WH-861型渦旋振蕩器 太倉市科教儀器廠；超聲波清洗器 昆山超聲波儀器有限公司。1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

分別稱取適量的SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水制0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，溶液置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期限一個(gè)月。

1.3.2 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取0.3g經(jīng)液氮研磨的富硒米曲霉粉末4 份置于10 mL的離心管中，加入5 mL 6 mol/L HCl溶液，用氮?dú)獯?0 min后封口。一份在110℃條件下水解24 h，另外3 份在50℃條件下分別水解24、48、72 h。離心15 min后取上清液，用超純水定容至100 mL備用。

1.3.3 樣品的衍生

取3 mL樣品溶液，加入2 mL pH 9.0硼砂-硼酸緩沖液和100 μmol/mL的CBNF衍生劑2 mL，封口，在65 ℃水浴條件下衍生40 min，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻，放置至室溫，振蕩，用pH 7.0磷酸緩沖液定容至10 mL后振蕩30 s，再靜置10 min。用0.22 μm有機(jī)過濾器過濾至上機(jī)小瓶，待用。

分別取0.1 mL的SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液按照如上方法進(jìn)行衍生。其反應(yīng)機(jī)理[12]見圖1。

圖1 SeMet與CNBF（a）、SeCys2與CNBF（b）和CNBF自身水解（c）反應(yīng)機(jī)理圖Fig.1 (a) Reaction scheme of CNBF with amine groups on SeMet; (b) Reaction scheme of CNBF with amine groups in SeCys2; and (c) hydrolysis of CNBF reagent

1.3.4 色譜條件

色譜柱：We l c h U l t i m a t e C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：乙腈-水（1∶1，V/V）；流動(dòng)相B：0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液；柱溫：31 ℃；檢測波長：240 nm；流速1.2 mL/min；梯度洗脫：0～25 min，65% A、35% B；25～30 min，75% A、25% B；30～34 min，90% A、10% B；34～40 min，100% A、0% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒代氨基酸提取方法的選擇

富硒米曲霉中硒代氨基酸是有機(jī)硒的主要形式，而有機(jī)硒主要存在于蛋白中，故采用水解蛋白的方式提取富硒米曲霉中的硒代氨基酸。目前蛋白水解的方式主要以酸水解法為主，但是普通的酸水解條件為110 ℃條件下水解24 h，在該方法中甲硫氨酸、胱氨酸/半胱氨酸常常會(huì)遭到破壞，易造成損失[13]。郝素娥等[14]采用6 mol/L的HCl溶液，50℃水解50 h的方法提取富硒酵母中的硒化合物，有機(jī)硒提取率達(dá)到61.3%；唐瑩瑩等[15]用6 mol/L的HCl溶液提取富硒大米中的硒化合物，提取時(shí)間分別為24、48 h，相對應(yīng)的提取溫度為110 ℃和50 ℃。結(jié)果顯示50 ℃條件下提取48 h所得的硒化合物含量高于110 ℃條件下提取24 h的量。因此本實(shí)驗(yàn)預(yù)建立一種條件溫和且操作簡單的前處理水解法，即降低水解溫度對富硒米曲霉中的硒代氨基酸進(jìn)行提取，并且比較了不同水解時(shí)間條件下，有機(jī)硒的提取量，其結(jié)果見表1。

表1 富硒米曲霉中硒化合物的測定Table1 The contents of selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

由表1可知，4 種水解方法相比較而言，50 ℃、24 h的水解條件下，提取的SeCys2的量最低，僅為1.12 mg/g，推測可能是由于蛋白未水解徹底導(dǎo)致；50 ℃、72 h條件下的最高，為1.27 mg/g，比110 ℃水解24 h的1.18 mg/g高7.6%，并且略高于50℃、48 h條件下的1.25 mg/g，SeMet均未檢出。綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選取反應(yīng)條件較溫和，反應(yīng)時(shí)間較短的50℃、48 h為本實(shí)驗(yàn)的水解條件。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

2.2.1 衍生劑的選擇

SeMet、SeCys2及大部分氨基酸本身并不能產(chǎn)生紫外吸收，必須經(jīng)過衍生化反應(yīng)，產(chǎn)生具有紫外吸收的衍生物才能被檢測。目前國內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的衍生劑有鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）[16-17]、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PΙTC）[18]、2,4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）[19]、丹酰氯（Dansyl-Cl）[20]、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯（6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）[21-22]、9-芴甲基氯甲酸酯[23-24]和CNBF等。

雖然衍生劑的種類很多，但沒有哪一種衍生劑能夠完全適合所有氨基酸的分析[25-27]。例如，OPA衍生法具有衍生步驟簡單、反應(yīng)速度快、剩余試劑不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是只能與一級氨基酸反應(yīng)，二級氨基酸不能與其直接反；Dansyl-Cl法可同時(shí)檢測包括亞氨基酸在內(nèi)的所有氨基酸，缺點(diǎn)是流動(dòng)相中的雜質(zhì)和衍生副產(chǎn)物對測定有干擾；DNFB法的優(yōu)點(diǎn)有衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、操作簡便、成本低等，衍生產(chǎn)物由于硝基苯環(huán)的引入，有較強(qiáng)的紫外吸收，因此具有較高的靈敏度，缺點(diǎn)是衍生過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物干擾測定，限制了DNFB在氨基酸分析中的應(yīng)用；PΙTC法可同時(shí)測定伯氨酸和仲氨酸，衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，缺點(diǎn)是PΙTC毒性大，且極易損耗色譜柱壽命。CNBF衍生條件為65 ℃條件下衍生40 min，與以上衍生劑相比具有反應(yīng)條件溫和、衍生時(shí)間短、成本低等優(yōu)勢，因此本實(shí)驗(yàn)采用CNBF做衍生劑進(jìn)行硒代氨基酸的檢測。

2.2.2 衍生劑用量對衍生效率的影響

為使衍生反應(yīng)完全，一般需要加入過量的衍生劑。實(shí)驗(yàn)了不同用量衍生劑對衍生效率的影響，當(dāng)反應(yīng)溫度65 ℃、反應(yīng)時(shí)間40 min時(shí)，隨著衍生劑用量的增大，色譜峰面積增大，一般當(dāng)衍生劑用量大于20 倍理論量時(shí)，峰面積不在變化，衍生反應(yīng)接近完全。本法選擇3.0 mL樣品溶液加入2 mL 100 mmol/L的CNBF衍生劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，約相當(dāng)于硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品量為0.1 mg/mL時(shí)的40 倍（考慮到CNBF自身的水解反應(yīng)）理論量。

2.2.3 衍生化反應(yīng)時(shí)間的選擇

在保持衍生反應(yīng)緩沖液pH值和衍生劑用量不變的情況下，于65 ℃水浴中分別衍生反應(yīng)不同時(shí)間（30～60 min），觀察反應(yīng)時(shí)間對色譜峰面積的影響。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，色譜峰面積呈上升趨勢，反應(yīng)40 min后，硒代氨基酸的色譜峰面積已趨于最大。故本法選用40 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.2.4 衍生反應(yīng)緩沖液pH值的選擇

選用硼砂-硼酸緩沖液，比較不同pH值條件下（pH 8.6～11.0）進(jìn)行衍生反應(yīng)對硒代氨基酸峰面積的影響。結(jié)果表明，在pH 9.0時(shí)硒代氨基酸的峰面積最大。故將衍生介質(zhì)的pH值定為9.0。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

SeMet和SeCys2與CNBF發(fā)生衍生化反應(yīng)，衍生物在240 nm處產(chǎn)生紫外吸收。考慮到富硒米曲霉中含有其他氨基酸對硒代氨基酸的測定產(chǎn)生一定的干擾，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和0.05 mol/L，pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相，根據(jù)米曲霉的特性對梯度洗脫的方法進(jìn)行優(yōu)化，最終在1.3.4節(jié)色譜條件下，使富硒米曲霉中的硒代氨基酸得到良好的分離。圖2為SeMet和SeCys2標(biāo)準(zhǔn)品的衍生色譜圖。

圖2 SeMet與SeCys衍生物的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of the CNBF-SeMet and SeCys2derivatives

2.4 富硒米曲霉樣品的衍生色譜分析

圖3 富硒米曲霉水解色譜圖Fig.3 Chromatogram of hydrolysate of selenium-enriched Aspergillus oryzae

富硒米曲霉在6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h后得到的產(chǎn)物進(jìn)行衍生反應(yīng)后的色譜分析如圖3所示。SeCys2得到了有效分離，但SeMet未出現(xiàn)明顯的色譜峰，可能是由于富硒米曲霉中含量過低或者是此提取方法對于SeMet的提取具有一定的局限性，具體原理有待進(jìn)一步研究。圖中其余未標(biāo)色譜峰可能是其他物質(zhì)，由于缺少明確的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，暫時(shí)無法確定。

2.5 方法的線性范圍與方法檢測限

取硒代氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液逐級稀釋成5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述試驗(yàn)方法衍生后上機(jī)測定，以硒代氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測限及線性范圍見表2。

表2 硒代氨基酸的檢測限及線性范圍Table2 Linear calibration ranges, regression equations, R2, LOD anndd LOQ of CNFB-selenoamino acids derivatives

由表2可知，SeMet標(biāo)準(zhǔn)曲線y=12 059x-63.538，R2=0.997 5，測定質(zhì)量濃度在5.0～100 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好；SeCys2標(biāo)準(zhǔn)曲線y=17 432x-87.428，R2=0.992 8，測定質(zhì)量濃度在5.0～100 mg/L也具有良好的線性關(guān)系，均可用于樣品的檢測分析。SeMet最低檢測限為0.41 mg/L，定量限為1.35 mg/L，其檢測靈敏度高于SeCys2的0.680 mg/L，高出39.7%，定量限也高于SeCys2的2.244 mg/L，高出66.2%。

2.6 方法的重復(fù)性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取同一份富硒米曲霉樣品5 份，按照上述方法測定硒代氨基酸含量，5 次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

取富硒米曲霉樣品4 份，加入不同量SeCys2標(biāo)準(zhǔn)液，按照實(shí)驗(yàn)方法測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。由表3可見，SeCys2有較高的加標(biāo)回收率，為94.8%～105.8%，使得有機(jī)硒的測定真實(shí)可信，滿足富硒米曲霉測定的需要。

表3 富硒米曲霉中SeCCyyss2的加標(biāo)回收率Table3 Spiked Recovery of SeCys2in selenium-enriched Aspergillus oryyzzaaee

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)研究確立CNBF柱前衍生-反相高效液相色譜法檢測富硒米曲霉中有機(jī)硒形態(tài)的分析方法。重點(diǎn)對樣品的提取方法和衍生方法進(jìn)行了研究。1）樣品的提取方法研究：比較不同溫度、不同時(shí)間對提取富硒米曲霉中硒代氨基酸的影響，并綜合考慮實(shí)驗(yàn)條件的選取與實(shí)驗(yàn)時(shí)間的消耗，采用一種溫和的實(shí)驗(yàn)條件-6 mol/L HCl溶液，50 ℃水解48 h的方法，提取樣品中的硒化合物，在確保實(shí)驗(yàn)定性定量結(jié)果的同時(shí)，提高了富硒米曲霉中硒代氨基酸的提取效率。2）硒代氨基酸衍生及分離研究：選擇CNBF柱前衍生，并對衍生劑用量、衍生時(shí)間以及衍生反應(yīng)緩沖液的pH值進(jìn)行了優(yōu)化，采用乙腈-水（1∶1，V/V）和pH 6.8乙酸-乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，使SeMet和SeCys2得到有效分離。該實(shí)驗(yàn)方法的檢測限低、精密度高，線性相關(guān)性良好，加標(biāo)回收率在94.8%～105.8%之間。與現(xiàn)在較為先進(jìn)的HPLC-MS聯(lián)用分析硒代氨基酸的方法相比，具有普及性強(qiáng)，樣品處理簡單，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，同時(shí)兼顧準(zhǔn)確性與經(jīng)濟(jì)性的優(yōu)勢，基本可以滿足硒形態(tài)分析的要求，能夠用于硒形態(tài)分析研究。

但同時(shí)實(shí)驗(yàn)尚有不足，有待改進(jìn)的地方。從色譜圖可以看出，目標(biāo)物的出峰時(shí)間太晚，耽誤檢測效率，是否可以通過某些手段，使目標(biāo)物的出峰時(shí)間提前，縮短檢測時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率等，本課題組還將會(huì)對此領(lǐng)域的研究做進(jìn)一步的探索。

[1] SCHRAUZER G N, WHITE D A. Elemental seleniumin organic selenium compounds: their chemistry and biology[J]. Bioinorganic Chemistry and Applications, 1983, 8(3): 303.

[2] WESTERMARK T. Selenium and selenides[J]. Acta Pharmacal Toxical, 1987, 4(1): 121.

[3] 潘艷. 富硒米曲霉發(fā)酵條件的探索[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2009.

[4] SMITH A M, PICCIANO M F. Relative bioavailability of selenocompounds in the laboratory rat[J]. Journal of Nutrition, 1987, 117(4): 725-731.

[5] 高愈希, 蒲云霞, 彭曉敏, 等. 反相離子對高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定富硒酵母中硒[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊, 2013(6): 701-704.

[6] 程建中, 楊萍, 桂仁意. 植物硒形態(tài)分析的研究綜述[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(2): 288-295.

[7] 葉韻青. 富硒酵母類保健食品中有機(jī)硒測定方法[J]. 輕工科技, 2013(4): 7-8.

[8] 陳尚衛(wèi), 戴軍, 吳勝芳, 等. 富硒酵母中硒蛋氨酸的GC-MS/MS測定[J].食品與機(jī)械, 2012, 28(2): 60-63.

[9] 劉揚(yáng), 張濤, 劉靜, 等. 運(yùn)用RPLC-ΙCP-MS對富硒酵母中硒形態(tài)分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 32(12): 1261-1265.

[10] DENG Biyang, SHΙ Aihong, LΙ Linqiu, et al. Determination of selenomethionine in selenium-enriched yeast using capillary electrophoresis on-line coupled with electrochemiluminescence detection[J]. Microchim Acta, 2009, 165(3/4): 279-283.

[11] 仲娜. 電感藕合等離子體質(zhì)譜(ΙCP-MS)及高效液相色譜與電感藕合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于富硒生物樣品中硒的化學(xué)形態(tài)組成及分布規(guī)律研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2007.

[12] SHΙ Tianyu, TANG Tao, QΙAN Kun, et al. High-performance liquid chromatographic method for determination of amino acids by precolumn derivatization with 4-chloro-3,5-dinitrobenzotrifl uoride[J]. Analytica Chimica Acta, 2009, 654: 154-161.

[13] 李玉玲, 李衛(wèi)華. 反相高效液相色譜法檢測奶粉中含硫氨基酸[J].食品科學(xué), 2012, 33(8): 167-170.

[14] 郝素娥, 滕冰. 硒酵母中有機(jī)硒及硒代氨基酸含量的測定方法[J].分析測試學(xué)報(bào), 1999, 18(3): 72-74.

[15] 唐瑩瑩, 袁建, 蔣旭玲, 等. 柱前衍生-反相高效液相色譜法研究稻谷中有機(jī)硒形態(tài)[J]. 糧食與油脂, 2013, 26(12): 26-28.

[16] PEREIRA V, PONTES M, CAMARA J S, et al. Simultaneous analysis of free amino acids and biogenic amines in honey and wine samples using in loop orthophthalaldeyde derivatization procedure[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1189(1/2): 435-443.

[17] RIGOBELLO-MASINI M, PENTEADO J C P, LIRIA C W, et al. Implementing stepwise solvent elution in sequential injection chromatography for fluorimetric determination of intracellular free amino acids in the microalgae tetraselmis gracilis[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 628(2): 123-132.

[18] FERNANDEZ-FIGARES I, RODRIGUEZ L C, GONZALEZCASADO A. Effect of different matrices on physiological amino acids analysis by liquid chromatography: evaluation and correction of the matrix effect[J]. Journal of Chromatography B, 2004, 799(1): 73-79.

[19] 李東, 孫家義. 2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法測定18 種氨基酸[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2004, 13(1): 18-20.

[20] NAVAL M V, GOMEZ-SERRANILLOS M P, CARRETERO M E, et al. Value of high-performance liquid chromatographic analysis of amino acids in thedetermination of Panax ginseng radix ertract effect incultured neurons[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1121(2): 242-247.

[21] BOSCH L, ALEGRIA A, FARRE R. Application of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate (AQC) reagent to the RP-HPLC determination of amino acids in infant foods[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 831(1/2): 176-183.

[22] KABELOVA I, DVORAKOVA M, CIZKOVA H, et al. Determination of free amino acids in beers:a comparison of Czech and foreign brands[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(8): 736-741.

[23] LOPEZ-CERVANTES J, SANCHEZ-MACHADO D I, ROSASRODRIGUEZ J A. Analysis of free amino acids in fermented shrimp waste by high-performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1105(1/2): 106-110.

[24] LOZNOV V, BENKOVA B, MATEVA L, et al. Liquid chromatography method for simultaneous analysis of amino acids and biogenic amines in biological fl uids with simultaneous gradient of pH and acetonitrile[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 860(1): 92-97.

[25] 朱曙東, 趙昇皓. 氨基酸的高效液相色譜分析[J]. 色譜, 1994, 12(1): 20-24.

[26] FAN Xinjun, YOU Jinmao, KANG Jingwu, et al. New reagents for determination of amino acids by liquid chromatography with precolumn fl uorescence derivatization[J]. Analytica Chimica Acta, 1998, 367(1/2/3): 81-91.

[27] TODOROKI K, ETOH H, YOSHIDA H, et al. A fluorous tagbound fl uorescence derivatization reagent, F-trap pyrene, for reagent peak-free HPLC analysis of aliphatic amines[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009, 394(1): 321-327.

Determination of Organic Selenium Compounds in Selenium-Enriched Aspergillus oryzae by Pre-Column Derivatization-RP-HPLC Method

LI Hongwei1, WANG Kaiping1, WU Yu1, TANG Zhengjiang1, TANG Fei1, LIU Guoqing1,2,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. Anhui Wan Jiang Poultry Industry Research Institute, Xuancheng 242000, China)

A reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method for the determination of organic selenium compounds in selenium-enriched Aspergillus oryzae was established. The extraction of organic selenium compounds from samples was performed through hydrolysis with 6 mol/L HCl solution for 48 h at 50 ℃. After pre-column derivatization with 4-chlorine-3,5-dinitrobenzotrifl uoride (CNBF), the derivatives were separated on a C18reversed-phase column through gradient elution with acetonitrile-water and pH 6.8 acetic acid-sodium acetate buffer solution. UV detection was carried out at 240 nm. The organic selenium compound in selenium-enriched A. oryzae was mainly selenocystine (SeCys2). The limit of detection (LOD) (RSN= 3) was 0.680 mg/L and the limit of quantitation (LOQ) (RSN= 10) was 2.244 mg/L. The linear range was 5.0-100 mg/L. The recoveries were in the range of 94.8%-105.8% and selenium-enriched A. oryzae contained 1.25 mg/g selenocystine. This method is simple, sensitive and accurate, and could be used to determine organic selenium compounds in selenium-enriched A. oryzae and related products.

selenium-enriched Aspergillus oryzae; organic selenium; selenoamino acids; pre-column derivatization-RP-HPLC

Q517

A

1002-6630（2015）22-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201522025

2015-01-07

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1401032006）

李紅衛(wèi)（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：li3017545@163.com

*通信作者：劉國慶（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail：liugq_168@163.com