何 滔，于婷婷，郭 赟，胡 驍，何 軒，鄭淑芳

大腸高分化腺癌與其癌旁組織的質(zhì)譜成像研究

何 滔，于婷婷，郭 赟，胡 驍，何 軒，鄭淑芳

目的：探討質(zhì)譜成像技術(shù)在大腸高分化腺癌與其癌旁組織蛋白質(zhì)組表達(dá)差異中的應(yīng)用，尋找與大腸腺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物。方法：應(yīng)用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)人體大腸高分化腺癌及其癌旁組織術(shù)中冰凍活檢組織進(jìn)行質(zhì)譜掃描，并用ClinProTools 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用遺傳計(jì)算法計(jì)算峰面積，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。結(jié)果：光鏡下觀察腺癌組織呈浸潤(rùn)和推擠式生長(zhǎng)，癌旁組織顯著纖維化伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，2種組織在大部分區(qū)域形成明顯邊界；腺癌組織與癌旁組織比較，表達(dá)顯著差異蛋白多肽共11個(gè)，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：對(duì)大腸高分化腺癌與其癌旁組織采用質(zhì)譜成像技術(shù)進(jìn)行對(duì)照研究能夠直觀反映出蛋白質(zhì)分子差異，有希望在惡性腫瘤根治術(shù)中判斷切緣是否有腫瘤組織殘留發(fā)揮重要作用。

質(zhì)譜成像；大腸腺癌；癌旁組織；蛋白質(zhì)

0 引言

大腸癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，目前通過(guò)手術(shù)及輔助放化療等醫(yī)療手段，患者生存率已明顯提高，但在已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期患者中，5 a生存率仍?xún)H有8%[1]。惡性腫瘤能否及時(shí)得到有效治療及治愈，關(guān)鍵在于能否早期發(fā)現(xiàn)與診斷。目前臨床實(shí)際工作中，大腸癌仍缺乏早期診斷特異性標(biāo)志物[2]，常用生化指標(biāo)如癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）特異性、敏感性都較差。

質(zhì)譜成像（mass spectrometry imaging，MSI）是一種基于基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）的新興分子成像技術(shù)。其將MALDI-TOF-MS和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，無(wú)需特殊的制片和染色，可以直接從生物組織切片表面獲得任意分子量蛋白或小分子代謝物的空間分布信息，具有高靈敏度、高分辨率、高通量的優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)最早于1997年被應(yīng)用于研究生物組織中蛋白質(zhì)的分布[3]，目前在蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和藥物代謝等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[4-5]。

本研究探討質(zhì)譜成像技術(shù)在大腸高分化腺癌及其癌旁組織的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異中的應(yīng)用，初步建立質(zhì)譜成像技術(shù)探尋大腸腺癌生物標(biāo)志物的方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 試劑

色譜純98.5%基質(zhì)三氟乙酸、乙腈、α-腈基-4-羥基肉桂酸、無(wú)水乙醇，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 儀器和材料

AutoFlex MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀，ImagePrep工作站，導(dǎo)電載玻片，質(zhì)譜成像分析軟件FlexImaging 3.0、FlexControl和ClinProTools2.0（德國(guó)布魯克公司）；HM525冰凍組織切片機(jī)（德國(guó)美康公司）；-80℃低溫冰箱（賽默飛公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集和儲(chǔ)存

手術(shù)送檢大腸腺癌及其癌旁組織標(biāo)本，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗血水，消毒干紗布拭干，刀片切取腫瘤組織并包入鋁箔，用液氮預(yù)冷后轉(zhuǎn)至-80℃低溫冰箱凍存。

1.3.2 冰凍切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

常規(guī)冰凍切片，切片厚度5 μm，常規(guī)HE染色、脫水、透明、封片。診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：高分化腺癌：呈腺管樣或乳頭樣結(jié)構(gòu)，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，突破黏膜肌層浸潤(rùn)達(dá)黏膜下層和肌層，腺樣結(jié)構(gòu)超過(guò)腫瘤的95%；癌旁組織：距離腫瘤1～2 mm，大腸壁殘留的正常間質(zhì)及增生的纖維組織、膠原和炎細(xì)胞等。選取確診的大腸高分化腺癌和癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，共5例。

1.3.3 質(zhì)譜成像組織切片樣品制備

-20℃冰凍切片機(jī)，組織不使用包埋劑，切片厚度10 μm。將組織切片轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電載玻片上，乙醇浸泡。真空干燥5 min后，送入ImagePrep工作站進(jìn)行芥子酸基質(zhì)（10 mg/ml，乙腈∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2）噴霧。組織切片噴霧結(jié)束后室溫自然干燥5 min后，轉(zhuǎn)移到不銹鋼靶板上進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用FlexImaging 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、ClinProTools 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用遺傳計(jì)算法計(jì)算峰面積，再進(jìn)行t檢驗(yàn)，P值小于0.05確定為顯著差異質(zhì)譜峰。

2 結(jié)果

2.1 組織冰凍切片、HE染色結(jié)果

選取經(jīng)病理醫(yī)生確診為大腸腺癌及其癌旁組織標(biāo)本5例（如圖1所示），光鏡下觀察腺癌組織呈浸潤(rùn)和推擠式生長(zhǎng)，癌旁組織顯著纖維化伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺癌組織與癌旁組織在大部分區(qū)域形成明顯邊界。

2.2 質(zhì)譜掃描和數(shù)據(jù)分析結(jié)果

在光鏡的觀察引導(dǎo)下，選取大腸腺癌與癌旁組織掃描區(qū)域，癌旁組織掃描區(qū)域距離腺癌組織1～2mm，質(zhì)譜掃描得到組織質(zhì)譜峰圖（如圖2所示）。在大腸腺癌和癌旁組織質(zhì)譜峰圖中，多肽簇峰集中于質(zhì)荷比（m/z）1 500～11 500之間。腺癌組織與癌旁組織比較，發(fā)現(xiàn)表達(dá)顯著差異蛋白多肽共11個(gè)，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)表達(dá)下調(diào)（如圖3所示，見(jiàn)表1），部分蛋白多肽顯著高表達(dá)于腺癌組織中（如圖4所示）。

圖1 組織冰凍切片、HE染色結(jié)果（×100）

圖2 癌旁組織和大腸腺癌質(zhì)譜峰圖

3 討論

質(zhì)譜成像技術(shù)是一種全新的分子成像技術(shù)，有較高的空間分辨力，可達(dá)8 μm[7]；有較高的靈敏度和較寬的檢測(cè)范圍，可檢測(cè)生物小分子、藥物、多肽及蛋白質(zhì)，樣本處理簡(jiǎn)單。與其他蛋白質(zhì)組研究技術(shù)相比，如雙向凝膠電泳、毛細(xì)血管電泳、蛋白芯片等，質(zhì)譜成像技術(shù)能在組織切片上直接對(duì)蛋白多肽進(jìn)行定位分析，提供所研究蛋白多肽在組織中的分布信息，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。目前大部分質(zhì)譜成像研究采用的是冰凍的新鮮組織，隨著技術(shù)的改進(jìn)，已經(jīng)有學(xué)者將該技術(shù)應(yīng)用于甲醛固定、石蠟包埋的組織[8]，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。有學(xué)者繼而將質(zhì)譜成像與組織芯片技術(shù)相結(jié)合，能高通量、快速、同時(shí)對(duì)上百種組織進(jìn)行比較研究[9-10]。目前，質(zhì)譜成像技術(shù)在疾病機(jī)理的研究中已廣泛應(yīng)用，尤其是在惡性腫瘤領(lǐng)域，如惡性黑色素瘤[11]、結(jié)腸癌[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]等。

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，癌旁組織起到了至關(guān)重要的作用，如血管生成、小淋巴管增生、炎癥因子表達(dá)、間質(zhì)纖維化等，影響腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[15-16]。質(zhì)譜成像技術(shù)在選取掃描區(qū)域時(shí)，與HE染色切片進(jìn)行實(shí)時(shí)比對(duì)，可選取距離腫瘤1～2 mm的癌旁組織進(jìn)行研究，有效避免腫瘤組織干擾。但前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)低分化腫瘤進(jìn)行研究，選擇掃描區(qū)域應(yīng)稍遠(yuǎn)離腫瘤組織，否則難以避免腫瘤組織干擾。

圖3 表達(dá)具有顯著差異的蛋白多肽圖

表1 差異分子統(tǒng)計(jì)表

圖4 組織切片的掃描圖和MALDI IMS圖（×40）

Lee等[17]運(yùn)用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌與癌旁組織進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)磷脂質(zhì)的表達(dá)譜能夠準(zhǔn)確區(qū)分癌及癌旁組織，準(zhǔn)確度達(dá)92.9%，且在腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中也有明顯表達(dá)差異。Meding等[18]運(yùn)用質(zhì)譜成像技術(shù)分別對(duì)來(lái)自食管、乳腺、結(jié)腸、肝、胃和甲狀腺的6種腺癌組織進(jìn)行比較，并成功鑒別了來(lái)源于結(jié)腸的肝轉(zhuǎn)移性腺癌。本實(shí)驗(yàn)將腺癌組織與癌旁組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)顯著差異蛋白多肽共11個(gè)，其中上調(diào)10個(gè)，下調(diào)1個(gè)，其中m/z 6 573.35和m/z 10 089.81 2種蛋白在腫瘤與癌旁組織中差異比較大，圖4（c）和（f）顯示了這2種差異蛋白的空間分布，可以看出這2種蛋白主要分布在腺癌組織中。前期對(duì)大腸高分化腺癌與大腸腺瘤的質(zhì)譜成像研究中，發(fā)現(xiàn)與腺瘤相比，m/z 6 573.35和m/z 10 089.81 2種蛋白同樣高表達(dá)于腺癌組織中，提示這2種蛋白可能為大腸腺癌組織的生物標(biāo)志物，有待于在進(jìn)一步研究中明確[19]。但目前由于技術(shù)限制，對(duì)組織中蛋白多肽進(jìn)行直接鑒定仍是難點(diǎn)[20-21]。

隨著質(zhì)譜成像技術(shù)的成熟和臨床應(yīng)用，其可用于標(biāo)記腫瘤組織的邊界，有望能在惡性腫瘤根治術(shù)中判斷切緣是否有腫瘤組織殘留發(fā)揮重要作用。

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（收稿：2014-12-25 修回：2015-04-15）

Mass spectrometry imaging of colorectal well-differentiated adenocarcinoma and paracarcinoma tissues

HE Tao1,YU Ting-ting2,GUO Yun3,HU Xiao4,HE Xuan1,ZHENG Shu-fang1
（1.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Logistics University of PAP,Tianjin 300162,China; 2.Bruker Daltonics Company,Beijing 100081,China;3.Department of Endocrinology and Hematology, the Affiliated Hospital of Logistics University of PAP,Tianjin 300162,China;4.Tianjin Key Laboratory for Biomarkers of Occupational and Environment Hazard,Tianjin 300162,China）

Objective To identify specific protein molecular markers for colorectal adenocarcinoma,and to compare welldifferentiated colorectal adenocarcinoma tissues with pericarcinomatous tissues using mass spectrometry imaging technology.Methods Frozen biopsy of colorectal well-differentiated adenocarcinoma and paracarcinoma tissues underwent mass spectrometry imaging,and ClinProTools 2.0 software was used for data analysis.Genetic algorithm was applied to the calculation of the peak area,and t-test was carried out.Results Optical microscope found that adenocarcinoma tissues showed infiltrative growth,paracarcinoma tissues had fiberized appearance accompanied by phlogocyte infiltration,and that the two kinds of tissues had clear boundaries in most areas.When compared with paracarcinoma tissues,adenocarcinoma tissues had 11 polypeptides expressed significantly differently,including 10 up-regulated ones and 1 down-regulated case.Conclusion Mass spectrometry imaging can intuitively reflect the differences in the protein molecules between well-differentiated adenocarcinoma of the colon and its adjacent tissues,which may be used to determine whether there is residual tumor tissue during malignant tumor operation.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（12）：19-21，45]

mass spectrometry imaging;colorectal adenocarcinoma;paracarcinoma tissue;protein

R318；R445

A

1003-8868（2015）12-0019-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.12.019

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃面上基金資助項(xiàng)目（11JC YBJC13000）；武警后勤學(xué)院面上基金資助項(xiàng)目（WYMZ201009）；武警后勤學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目（WYQ201101）

何 滔（1981—），男，主治醫(yī)師，主要從事臨床病理及消化系統(tǒng)腫瘤方面的研究工作，E-mail：hetao_1981@163.com。

300162 天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院病理科（何 滔，何軒，鄭淑芳），內(nèi)分泌血液科（郭 赟）；100081 北京，布魯克·道爾頓公司（于婷婷）；300162天津，天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（胡 驍）

鄭淑芳，E-mail：zhengshf@126.com