汪 凱，李文超，顧有方

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

雞球蟲病疫苗的研究及其臨床應用

汪 凱，李文超，顧有方*

(安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100)

雞球蟲病是一種分布廣泛，嚴重危害雞生長發(fā)育的腸道原蟲病。長期以來，主要依靠藥物來控制雞球蟲病，由于球蟲耐藥蟲株的出現(xiàn)，政府對抗球蟲藥使用的限制或禁止，使得用疫苗來控制雞球蟲病日益受到重視。本文對球蟲疫苗的研究進展做一綜述。

雞球蟲??；疫苗；進展

雞球蟲病是造成現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟損失最大的疾病之一[1]，全世界每年由雞球蟲病造成的經(jīng)濟損失高達幾十億美元。我國是養(yǎng)雞大國，占世界總養(yǎng)雞量的1/10，每年由雞球蟲病造成的直接和間接經(jīng)濟損失更是難以估計。目前控制球蟲病的主要方法仍然是使用抗球蟲藥，但由于耐藥蟲株，甚至多重耐藥蟲株的出現(xiàn)，公眾對食品藥物殘留的日益關注，加上研制新藥成本費用高以及政府對抗球蟲藥使用的限制或禁止，使得抗球蟲藥的進一步使用舉步維艱，迫使人們尋找一種更好的方法來防治球蟲病[2]。Beach等[3]首次報道雞感染E.tenella后能夠產(chǎn)生對同源株攻蟲的抵抗力，揭開了球蟲疫苗研究的序幕，1952年，世界上第一個商用活球蟲疫苗Coccivac?誕生，時至今日，球蟲疫苗的研究已取得了可喜的進展，并且已在養(yǎng)雞業(yè)，尤其是蛋雞和種雞養(yǎng)殖中得到了較為廣泛的應用，成為替代化藥治療球蟲病的較為理想的可選方案之一，取得了較為明顯的經(jīng)濟和社會效益[4]。本文對雞球蟲疫苗的研究進展及臨床應用綜述如下。

1 活球蟲疫苗

由于感染雞的球蟲種類有多種，因此此類疫苗往往由不同種的球蟲卵囊組成，有些還含有同一個種的不同蟲株(如E.maxima)?？傮w而言，防治肉雞的球蟲活苗一般包括E.tenella，E.acervulina和E.maxima，防治蛋雞的疫苗要盡可能含有雞球蟲所有種，尤其要有E.necatrix。依據(jù)球蟲疫苗使用蟲株的特征，可分為強毒活苗，弱毒活苗和耐離子載體藥物活苗三類。

1.1 野生強毒球蟲疫苗

最早用免疫的蟲苗為自然活毒卵囊，這些蟲株是直接從田間分離的，保持天然毒力，具有較強的致病性，這類疫苗以Coccivac和Immucox為代表。目前，這類疫苗廣泛應用于世界上一些禽類養(yǎng)殖大國，已商業(yè)化應用了將近60年，如2001～2004年僅Coccivac?和Immucox?就銷售了25億頭份[5]。

1.2 弱毒活球蟲疫苗

由于強毒球蟲疫苗使用的是直接從田間分離的強毒蟲株，存在安全性較差的缺點。自上世紀70年代起，人們開始將目光轉(zhuǎn)向人工篩選致弱球蟲疫苗，并陸續(xù)獲得了一系列致弱球蟲株，以Paracox和Livacox等為代表。這一類疫苗一般是通過雞體反復傳代或通過雞胚傳代致弱而獲得[6]，其內(nèi)生發(fā)育時間縮短，大大降低了疫苗致病性，但保持良好的免疫原性，因此此類疫苗的使用可以避免野生強毒球蟲疫苗的致病性問題，而且誘導的免疫保護作用不會出現(xiàn)其它較常用的活卵囊免疫帶來的免疫效力下降的問題[7]，但是，早熟株的選育要經(jīng)很多代的篩選，費時費力，而且卵囊產(chǎn)量較低，生產(chǎn)費用相對較高。

1.3 耐離子載體藥物活苗

目前也發(fā)展了一些對全部或部分球蟲藥物有抗性的活球蟲疫苗，如Nobilis?. COX ATM和VACM?。Nobilis?.COX ATM 是包含E.acervulina，E.maxima和E.tenella三個耐離子載體藥物類的強毒疫苗。Li等[8]對三個田間分離強毒株，在致弱過程中選擇了對離子載體具有抗性的蟲株作為單一的多價口服疫苗，在免疫接種聯(lián)合離子化載體組觀察到了比接種免疫組或藥物治療組較好的效果。上述疫苗在肉仔雞的早期預防治療階段，具有一定的優(yōu)勢，因為在雞抗球蟲免疫力發(fā)展不完全的前3～4周，可以在使用疫苗以產(chǎn)生對球蟲的免疫力的同時使用離子載體類藥物預防球蟲病。這種聯(lián)合使用由于在免疫力發(fā)展階段減少了野毒株感染的壓力，將進一步在雞感染球蟲病的總體風險。

2 亞單位疫苗

亞單位疫苗僅包含整個蟲體中部分能刺激機體免疫系統(tǒng)效果較好的保護性抗原蛋白，而不含蟲體的其它分子。和全蟲疫苗相比，亞單位疫苗有著更高的穩(wěn)定性、安全性和更低的副作用，因此受到廣泛的關注。該類疫苗包括三種類型：(a)從天然組織中純化的蛋白，(b)重組抗原蛋白以及(c)化學小肽疫苗。

商品化的配子體抗原疫苗Cox?Abic是迄今惟一可以稱為“亞單位”疫苗的球蟲疫苗，其通過誘導母源抗體來控制球蟲病[9]。該疫苗含滅活的經(jīng)親和純化的巨型艾美球蟲配子體56，82和230 kDa蛋白。

對重組表達的亞單位疫苗而言，球蟲生活史不同階段保護性抗原的鑒別在其發(fā)展中至關重要。從抗原的蟲種來源來看，抗原基因主要來源于E.tenella、E.acervulina、和E.maxima，從抗原來源的蟲體階段來看，主要集中在子孢子入侵相關蛋白上，包括折光體、微線、棒狀體等細胞器抗原，其次是蟲體表面的重組抗原。目前已鑒定出來的主要抗原有柔嫩艾美耳球蟲的EtlA1、GX3262、Etrop/5、EtS3a、Et7b2、GX5401、Eth16、TA4、PGET10、PGET20、PGET30、PGET40、PEtk2、SO7、λMZS-7、AMA1、IMP等，堆型艾美耳球蟲的EAMZp30-40、MA1、MA16、EalA、CMZ-8、CSZ-1、1P等，巨型艾美耳球蟲的Em70/2、λgb、λb2、PEM70/1、gam56、gam82、AMA1、IMP等。這些篩選的球蟲抗原基因，不少已經(jīng)進行過免疫保護效果試驗，具有良好的免疫原性和保護效力，這些為球蟲疫苗的研究奠定了堅實基礎。

3 DNA疫苗

目前，在球蟲DNA疫苗構(gòu)建上選用的載體主要為pcDNA和pVAX1，抗原主要來源于E.tenella、E.acervulina、E.necatrix和E.maxima，隨著球蟲抗原研究進展，越來越多的保護性抗原被篩選并構(gòu)建成DNA疫苗。目前，針對E.tenella的DNA疫苗主要有pcDNA-SO7[10]、pcDNA-5401[11]、Pvax1-Rho[12]、pcDNA3.1-TA4和pcDNA3.1-Et1A-TA4[13]、pcDNA3.1-TA4-IL-2和pcDNA3.1-TA4[14]、pcDNA4.0-MZ和pcDNA4.0-MZ-IL17[15]、pVAX-SO7和 pVAX-SO7-IL-2[16]等。針對E.maxima的DNA疫苗有pcDNA-Gam56[17]、pVAX 1.0-EM8-IL-2[18]、pcDNA-AMA1和pcDNA-IMP[2]等。針對E.necatrix的DNA疫苗有pVAXl.0-NA4-IFN-γ、pVAXl .0-NA4-IL-2[19]。針對E.acervulina的DNA疫苗有pVAX1.0-3-1E- IFN-γ[20]、pVAX1-cSZ2和pVAX1-cSZ2-IL-2[21-22]、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX- LDH-IL-2[23]、pcDNA3.1-3-1E和 pcDNA3.1-3-1E-linker-mChIL-15[24-25]、pVAX1.0-cSZ-JN1[26]和pVAX1.0-cSZ-JN2[27]等。

4 重組活載體疫苗

目前在球蟲疫苗研究中應用的活載體疫苗主要有沙門氏菌[28]、卡介苗[29]、乳酸菌[30]以及重組禽痘病毒[31]等, 抗原基因主要來源于E.tenella、E.acervulina、E.necatrix和E.maxima，抗原基因有E. tenella的SO7[31]、Rho[31]、ADF[32]、TA4[33]，E.necatrix的MIC2[34]，E.acervulinacSZ1[35]和E.maxima的AMA1[29]等。

5 可食用疫苗

在某種經(jīng)遺傳改造的植物細胞內(nèi)表達球蟲保護性抗原，即可以從植物細胞中提取純化出重組蛋白免疫動物，也可以直接把轉(zhuǎn)基因植物飼喂動物而獲得免疫。在球蟲疫苗研究領域，已經(jīng)在煙草中成功表達了E.tenellaMIC2[36]，給雞飼喂上述表達EtMIC2的煙草葉子可以導致較高的抗體反應和明顯減少的卵囊分泌。表達EtMIC2和EtMIC2的煙草葉子聯(lián)合飼喂雞可導致較高的抗體水平和較好的體重增加[37]。

6 樹突狀細胞疫苗

樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，可誘導很強的初次免疫應答。Del Cacho等[38]從E.tenella感染雞分離CD45+的DC細胞，裝載E.tenella子孢子，免疫試驗顯示與對照組相比試驗組雞體重獲得增加，飼料轉(zhuǎn)化率降低，糞便卵囊分泌減少，腸道病變減輕，死亡率較低。隨后的試驗顯示分別裝載E.tenella，E.acervulina和E.maxima子孢子抗原DC細胞來源的衍生泡免疫雞均可以對相應同源蟲株攻蟲有一點的免疫保護力。

7 新型佐劑的研究

現(xiàn)有球蟲基因工程疫苗由于在免疫保護效力方面的不足，尚不能替代球蟲活疫苗，因此提高基因工程疫苗免疫保護效力成為一個亟待解決的問題。其中策略之一就是尋找合適的免疫佐劑。

細胞因子是一類能刺激活化和調(diào)節(jié)免疫細胞的可溶性小分子多肽或蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)多種細胞因子如IL-2、GM-CSF和IFN-γ等具有佐劑效應，其與球蟲重組蛋白/DNA疫苗一起免疫雞后，能增強對球蟲攻蟲的免疫保護作用[39]。

含未甲基化的CpG基序的短寡脫氧核昔酸具有佐劑效應，可以增強天然免疫和誘導獲得性免疫反應。Dalloul等[40]證實CpG ODNs可以增強雞對球蟲感染的抵抗能力，顯示CpG ODNs可能是未來球蟲重組疫苗的良好佐劑。

皂昔是從天然藥物中提取的一類重要的生物活性成分，很多皂苷如Quil A具有佐劑效應，既能刺激外源性抗原產(chǎn)生Thl免疫應答，又能誘導產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞。Du等[41]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷可以增強E.tenella重組抗原5401對同源株攻蟲的免疫保護作用。Zhang等[42]發(fā)現(xiàn)包含人參皂苷的納米粒子可以提高E.tenella重組profilin的免疫效力。免疫刺激復合物(ISCOMs)與植物皂苷及E.tenella抗原組裝免疫刺激復合體免疫雞，具有良好的保護效果，而且比Quil A毒性更低，可用于球蟲的預防[43]。包括Quil A的新型佐劑QCDCR與profilin蛋白聯(lián)用免疫雞，攻蟲后可顯著降低感染雞腸道病變[44]。隨后試驗證實profilin與QCDCR聯(lián)用可以抵抗E.acervulina的感染[45]，而且profilin與QCDCR聯(lián)用通過蛋內(nèi)免疫可以提高后代雞體重獲得和細胞因子的表達水平。

8 展望

盡管球蟲疫苗尤其是基因工程疫苗研制取得了巨大進步，但由于雞球蟲種類較多，基因組較大，保護性抗原的種類繁多，生活史復雜、發(fā)育階段多，而且不同的發(fā)育階段的基因表達情況也不一致等因素，迄今基因工程疫苗由于在免疫保護力方面不足而無法替代傳統(tǒng)活苗。因此，未來需要進一步研究球蟲蟲體與宿主之間的相互作用，進而利用各種手段如基于細胞水平和糖水平的芯片技術(shù)、全基因組范圍篩查方法等鑒別出各種重要的保護性抗原，進而采用合適的抗原傳遞系統(tǒng)，我們有理由相信球蟲基因工程疫苗最終能在雞球蟲病的免疫防治中發(fā)揮重要作用。

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(責任編輯：馬世堂)

Study on Vaccines Against Chicken Coccidiosis and Its Application

WANG Kai, LI Wen-chao, GU You-fang*

(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Coccidiosis is a ubiquitous intestinal protozoan infection of poultry which seriously impairs the growth and feed utilization of infected chickens. Conventional disease control strategies rely heavily on chemoprophylaxis. The continual emergence of drug-resistant strains of Eimeria, coupled with the increasing regulations and bans on the use of anticoccidial drugs, prompts the development of vaccine against coccidiosis. This study reviews the latest advances in live and recombinant vaccine development against coccidiosis.

Coccidisos; Vaccine; Advance

2015-08-01

安徽省第七批“115”產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目；安徽省教育廳重大項目(KJ2014ZD09)；安徽省教育廳重點項目(KJ2015A189)；安徽科技學院校級重點項目(ZRC2014406);安徽科技學院重點學科項目(AKZDXK2015A04)。

汪凱(1991-) ，女，安徽省池州市人，在讀碩士研究生，主要從事動物寄生蟲學與寄生蟲病學研究。*通訊作者:顧有方，教授，E-mail:youfanggu@163.com。

S831.7

A

1673-8772(2015)06-0006-05