史碧波

（西昌學(xué)院 輕化工程學(xué)院，四川 西昌 615013）

培養(yǎng)條件對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響研究

史碧波

（西昌學(xué)院 輕化工程學(xué)院，四川 西昌 615013）

試驗(yàn)初步探討了毛霉培養(yǎng)條件對其胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響。以單一菌株為研究對象，探討了培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖瓶速度等因素對菌株胞內(nèi)代謝產(chǎn)物HPLC圖譜的影響，分析各因素的影響大小，建立了規(guī)范化的培養(yǎng)流程：選用馬鈴薯制作馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進(jìn)行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在溫度設(shè)為20℃的恒溫?fù)u床中以150 r/min搖瓶速度搖瓶培養(yǎng)4 d后取出。

毛霉；培養(yǎng)條件；胞內(nèi)代謝產(chǎn)物；高效液相色譜；中藥色譜指紋圖譜；相似度評價(jià)系統(tǒng)

0 引言

毛霉（Mucor spp.）是我國食品加工或化工生產(chǎn)中常利用的一類陸生真菌，但其中的某些種可能產(chǎn)生毒素，某些種是引起腐敗或感染致病的微生物[1]，所以，從分類上弄清毛霉的種類，即準(zhǔn)確的分類鑒定對更好利用毛霉或規(guī)避毛霉的危害至關(guān)重要。傳統(tǒng)的毛霉分類鑒定方法是形態(tài)學(xué)結(jié)合生理生化特征[2]，但該方法不易掌握，很多有經(jīng)驗(yàn)的微生物學(xué)家也有可能作出錯(cuò)誤的分類鑒定結(jié)果。另一種目前常采用的方法是DNA分子鑒定，但目前對毛霉的分子鑒定還未找到最為合適的分類標(biāo)記，目前最常用的ITS序列不能對多種毛霉進(jìn)行分類鑒定[3]。我們想探索HPLC檢測毛霉菌絲提取物用于分類鑒定的可行性，為毛霉分類鑒定提供一種新的方法。高效液相色譜是現(xiàn)代較為成熟的一種分析檢測手段，在中草藥的分類及品質(zhì)鑒定方面有眾多報(bào)道[4]，在微生物的分類鑒定方面也有一些報(bào)道，如利用高效液相色譜檢測細(xì)菌DNA的G+C含量、枝菌酸分析、醌類測定和多胺分析，從而達(dá)到對細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定的目的[5]。我們設(shè)想將毛霉中的化學(xué)物質(zhì)提取出來，進(jìn)行HPLC檢測，通過圖譜的相似程度或者差異程度來判斷是否是一種毛霉。這種方法可行的前提之一是在標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)過程中毛霉的代謝產(chǎn)物較為穩(wěn)定。本文主要探討培養(yǎng)條件，如不同培養(yǎng)基、不同接種量、不同搖瓶速度、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等條件對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響，旨在建立規(guī)范化的培養(yǎng)條件，減少培養(yǎng)條件對檢測結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

毛霉菌株：Mucor circinelloides f.circinelloides，編號為CGMCC 3.4916，購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)試劑

（1）蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基：稱取蛋白胨4 g/L，葡萄糖20 g/L，溶解后分裝，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后待用。

（2）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊放入1 000 mL水中煮20～30 min，用8層紗布過濾，取其濾液，加20 g葡萄糖溶解，定容至1 000 mL，分裝，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后待用。

（3）流動(dòng)相制備：檢測時(shí)所用流動(dòng)相為pH4.0的甲酸水溶液和色譜純乙腈。流動(dòng)相均經(jīng)過0.45μm濾膜過濾。

（4）提取溶劑制備：提取溶劑為50%甲醇溶液。

1.3 試驗(yàn)儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配紫外檢測器）：美國Agilent公司；手提式高壓殺菌鍋：鄭州杜甫儀器廠；VC-S-1040超凈工作臺：北京嘉創(chuàng)博遠(yuǎn)凈化科技有限公司；SHA-CII水浴恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；ESJ200-4電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：臺州市博奧真空設(shè)備有限公司；JP-C100型超聲波振蕩清洗儀：廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司。

1.4 方法

將編號為CGMCC 3.4916的毛霉菌株分別在不同條件下培養(yǎng)獲得菌絲，經(jīng)處理檢測后用于毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性分析。

將保藏菌株用無菌水配制成為1萬個(gè)/mL的孢子懸液，然后接種到經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基中按各種培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，一定時(shí)間后取出。將培養(yǎng)物過濾，用無菌水洗滌菌絲，用無菌濾紙吸干菌絲表面水分，用液氮冷凍研磨成菌絲粉末。按質(zhì)量體積比10∶1(mg∶mL)的比例稱量菌絲粉末和提取溶劑到可密封的小玻璃瓶中，在30℃恒溫條件下超聲提取3 h后取出，用0.45μm的濾膜過濾待測。檢測時(shí)采用配備紫外檢測器的高效液相色譜儀，色譜條件為：Agilent Eclipse XDB-C8色譜柱（4.6×150 mm，5μm）；流動(dòng)相流速0.6 mL/min；流動(dòng)相為pH4.0的甲酸水溶液和乙腈進(jìn)行洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min：100%水（pH4.0）；30 min∶5%水（pH4.0），95%乙腈；60 min∶5%水（pH4.0），95%乙腈；色譜柱溫度35℃；檢測波長215.5 nm；進(jìn)樣20μL。檢測后的圖譜用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”進(jìn)行匹配[13]，計(jì)算相似度，比較分析各培養(yǎng)條件對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

在高效液相色譜配備的化學(xué)工作站軟件中對所得圖譜進(jìn)行積分，導(dǎo)出為AIA格式，然后將AIA格式的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”，該軟件可以對圖譜進(jìn)行匹配，得到各圖譜在色譜峰的保留時(shí)間、峰面積上的匹配結(jié)果，進(jìn)一步得到各圖譜的相似度[6]。根據(jù)所得相似度進(jìn)行圖譜間的差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對圖譜的影響

選擇不同地方購買或不同品種的馬鈴薯，蛋白胨選擇不同廠家或不同批次產(chǎn)品，分別制作3個(gè)批次的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進(jìn)行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在同一搖床中（20℃）搖瓶培養(yǎng)5 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進(jìn)行處理檢測，圖譜如圖1所示。圖譜相似度結(jié)果如表1所示。

圖1 不同培養(yǎng)基的HPLC圖譜

表1 不同培養(yǎng)基的HPLC圖譜相似度

從圖1可以很直觀地看出，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基與蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基的菌絲提取物間存在明顯的差異，表1的數(shù)據(jù)中二者之間的相似度在0.003～0.016之間，相似度非常小，這表明，如果是用2種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)所得的菌絲提取物則沒有可比性，所以我們在進(jìn)行HPLC檢測菌絲提取物時(shí)一定要保證所比較的菌絲提取物都是使用一種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)而得。

那么，究竟選擇哪一類培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)更為恰當(dāng)，這要從2類培養(yǎng)基中的組內(nèi)差異來分析。不同馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)物的相似度在0.720～0.941之間，相似度較大，表明用馬鈴薯培養(yǎng)基來培養(yǎng)的毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性較好；3種蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)物的相似度在0.168～0.428之間，表明不同蛋白胨培養(yǎng)的毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性較差。所以，相對于蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基而言，選擇馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基更有利于減少培養(yǎng)基對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響。這個(gè)結(jié)果也反映了標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)基對微生物代謝穩(wěn)定性的重要作用。

2.2 培養(yǎng)溫度對圖譜的影響

配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，分別放在10、20、30℃的搖床中，搖瓶培養(yǎng)5 d，取出后分離出菌絲，處理提取后上HPLC檢測，比較圖譜，分析培養(yǎng)溫度對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性影響。經(jīng)分析軟件得相應(yīng)圖譜的相似度，見表2。

表2 不同溫度的HPLC圖譜相似度

由表2可以看出相同溫度條件下毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物較為穩(wěn)定，相似度在0.897～0.983之間，其中以20℃條件下最大。不同培養(yǎng)溫度條件下毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物變化較大，相似度在0.240～0.753之間，表明培養(yǎng)溫度對圖譜的影響較大。其中，培養(yǎng)溫度為10℃與20℃的相似度為0.724～0.753，圖譜相似度較大，表明在10～20℃之間培養(yǎng)的毛霉代謝物較穩(wěn)定；20℃與30℃的相似度為0.320～0.342，表明在20℃～30℃之間培養(yǎng)的毛霉代謝物不穩(wěn)定，這可能是因?yàn)槊苟鄬儆诘蜏仄贩N，其適宜生長溫度一般在25℃以下，溫度過高其生長和代謝出現(xiàn)異常所致。所以，我們選擇培養(yǎng)溫度在20℃進(jìn)行規(guī)范操作，以盡量減小培養(yǎng)溫度對圖譜的影響。

2.3 接種量對圖譜的影響

配制馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，滅菌后分別接入1、2、3、4、5 mL的同批次毛霉孢子懸液，在同一個(gè)搖床內(nèi)（20℃）搖瓶培養(yǎng)5 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進(jìn)行處理檢測，分析接種量對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性影響。經(jīng)分析軟件得相應(yīng)圖譜的相似度，見表3。

表3 不同接種量的HPLC圖譜相似度

由表3看出相同接種量條件下毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物較為穩(wěn)定，相似度在0.962～0.986之間，其中以2%接種量條件下最大。不同的接種量之間的相似度在0.338～0.843之間，說明接種量對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響較大。表中2 mL接種量與1 mL接種量、3 mL接種量的圖譜相似度都較大，所以我們選擇接種2 mL進(jìn)行規(guī)范操作，以便在接種量略有偏差時(shí)對圖譜影響可以降到最低。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對圖譜的影響

配制蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基，滅菌后接入2mL的毛霉孢子懸液，在同一個(gè)搖床內(nèi)分別搖瓶培養(yǎng)3、4、5、6、7 d后取出分離出菌絲，經(jīng)HPLC檢測，比較圖譜，分析培養(yǎng)時(shí)間對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性影響。經(jīng)分析軟件得相應(yīng)圖譜的相似度，見表4。

由表4可以看出相同培養(yǎng)時(shí)間的毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物較為穩(wěn)定，相似度在0.965～0.993之間，其中以培養(yǎng)4 d條件下最大。不同的培養(yǎng)時(shí)間相似度在0.218～0.917之間，相似度差距較大，表明培養(yǎng)時(shí)間對圖譜的影響較大，說明培養(yǎng)時(shí)間對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性影響較大。其中，培養(yǎng)3～5 d的圖譜相似度在0.824～0.917之間，這說明培養(yǎng)3～5 d的菌絲代謝物較為穩(wěn)定；而培養(yǎng)6 d、7 d的圖譜相似度降低很多，可能是由于菌絲老化，其代謝物發(fā)生較大變化所致。所以，我們選擇培養(yǎng)4 d進(jìn)行規(guī)范操作，以盡量減小培養(yǎng)時(shí)間對圖譜的影響。

表4 培養(yǎng)時(shí)間的HPLC圖譜相似度

2.5 搖瓶速度對圖譜的影響

配制蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基，滅菌后接入2 mL毛霉孢子懸液，在20℃恒溫器中分別在靜置狀態(tài)、100、150、200 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進(jìn)行處理檢測，分析搖瓶速度對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物穩(wěn)定性影響。經(jīng)分析軟件得相應(yīng)圖譜的相似度，見表5。

表5 不同搖瓶速度的HPLC圖譜相似度

由表5可以看出，在其它培養(yǎng)條件相同而搖床轉(zhuǎn)速不同的情況下，圖譜相似度在0.906～0.974之間，說明搖床轉(zhuǎn)速對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響不大，在培養(yǎng)過程中不用特別在意搖床轉(zhuǎn)速。雖然靜止培養(yǎng)的圖譜與其它相似度也不錯(cuò)，但相差略大，而且靜止培養(yǎng)會使毛霉只在表面生長，所以我們的規(guī)范化操作還是確定在搖床中進(jìn)行，控制轉(zhuǎn)速在150r/min左右即可。

3 結(jié)論和討論

試驗(yàn)探討了培養(yǎng)過程中不同培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖瓶速度等因素對毛霉胞內(nèi)代謝產(chǎn)物HPLC圖譜的影響，根據(jù)圖譜的相似度差異確定應(yīng)該采取的規(guī)范化培養(yǎng)操作如下：可選用馬鈴薯制作馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，按每支18×180 mm試管裝載30 mL進(jìn)行分裝，滅菌后接種2 mL的孢子懸液，在溫度設(shè)為20℃的搖床中以150 r/min搖瓶速度搖瓶培養(yǎng)4 d后取出，過濾后取毛霉菌絲進(jìn)行處理檢測。

在對菌株進(jìn)行規(guī)范化培養(yǎng)中，可明確看出選用哪種培養(yǎng)基是最為重要的，雖然在試驗(yàn)比較中顯示了馬鈴薯葡萄培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛霉菌絲比蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛霉菌絲有更穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，但是馬鈴薯畢竟有很多不同的品種，其成分也有較大差異，可能在各地制備的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基就會體現(xiàn)出較大差異，這對保證代謝產(chǎn)物穩(wěn)定不利。所以，標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)基研制是必要的工作。

注釋及參考文獻(xiàn)：

[1]羅曉妙，高玉強(qiáng)．高產(chǎn)胞外蛋白酶毛霉的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]．西昌學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2014(12):2．

[2]廖永紅,任文雅,伍松陵，等．兩株酒曲毛霉的分離及Biolog微生物系統(tǒng)分析鑒定[J]．食品工業(yè)科技,2010(1):191-193．

[3]Walther G．,Pawlowska J，Alastruey-lzquierdo A，et al．DNA barcoding in Mucorales:an inventory of biodiversity．Persoonia, 2013(30)：11-47．

[4]中藥指紋圖譜研究技術(shù)[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002．

[5]姜遠(yuǎn)良．化學(xué)分類法在細(xì)菌和真菌系統(tǒng)分類學(xué)中的應(yīng)用和發(fā)展[J]．遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),1995(2):152-155．

[6]謝培山．中藥色譜指紋圖譜[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社．2005．

Effect of Culture Conditions on the Stability of Mucor Intracellular Metabolites

SHI Bi-bo
(School of Applied and Chemical Engineering,Xichang College,Xichang,Sichuan 615013)

The influence of culture conditions on Mucor intracellular metabolites stability was investigated in this paper.A Mucor strain was cultured in different medium,by different inoculation volume,for different culture time,at different culture temperature and different shaking speed,and then the cultures were detected on HPLC after extracting by 50%methanol solution.Through analysis of HPLC fingerprints,the standardized training process was established∶potato dextrose was chose to be the medium,and the medium was packed to 18 x 180 mm test tube (30mL/tube).2 mL of the spore suspension was inoculated in the medium after sterilization,and then the tube was placed in thermostatic shaker to culture for 4 d at 20℃and 150 r/min.

Mucor；intracellular metabolites；High performance liquid chromatography(HPLC)；Traditional Chinese Medicine(TCM)；chromatographic fingerprint similarity evaluation system

S688.4

A

1673-1891（2015）04-0025-04

2015-09-08

史碧波（1977-），男，湖北天門人，副教授，碩士，研究方向：特色資源研究與開發(fā)。