潘高峰，郜玉峰，葉嬌嬌，姜同翠，沈玉君，沈玉先

MANF蛋白表達(dá)水平與肝纖維化程度的相關(guān)性研究

潘高峰1，郜玉峰1，葉嬌嬌1，姜同翠2，沈玉君2，沈玉先2

目的探討中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（MANF）蛋白在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用及其與臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。方法 采用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（ITRAQ）蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化法檢測(cè)肝臟穿刺組織中MANF蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與肝臟炎癥纖維化分期的關(guān)系；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照（NC）、乙肝病毒攜帶者（ASC）、慢性乙型肝炎患者（CHB）及乙肝后肝硬化患者（LC）外周血白細(xì)胞中MANF mRNA的表達(dá)水平，分析其與不同階段慢性HBV感染者的臨床病毒學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果MANF蛋白主要在肝細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，其表達(dá)水平隨著肝臟炎癥及纖維化的程度加重而升高。NC組、ASC組和CHB組分別與LC組比較，MANF mRNA的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MANF mRNA（HBsAg）＜1.5×106IU／L、（1.5×106～2.0×107）IU／L和＞2.0×107IU／L 3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽(yáng)性組與陰性組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；在膽紅素正常組與異常組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 MANF蛋白可能參與了慢性HBV感染者肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，并與其臨床特點(diǎn)相關(guān)。

MANF；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；慢性乙型肝炎；肝纖維化

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在慢性乙型肝炎－肝纖維化－肝硬化轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，但確切機(jī)制尚未完全闡明。大量研究［1］證實(shí)，持續(xù)的HBV復(fù)制和表達(dá)可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）應(yīng)激，ER應(yīng)激與HBV感染后肝臟非可控性炎癥的發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，但確切的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）基因編碼的蛋白主要位于ER和高爾基體，是一種分泌性蛋白［2］。目前研究［3－5］表明，ER應(yīng)激可以上調(diào)MANF基因的表達(dá)和蛋白的分泌，在帕金森病、腦缺血、心肌缺血等多種病理狀態(tài)下發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。ER應(yīng)激上調(diào)MANF蛋白表達(dá)的作用可能在于抑制ER應(yīng)激引起的過(guò)度炎癥和纖維化反應(yīng)，但MANF蛋白與慢性HBV感染后炎癥和纖維化發(fā)展的相關(guān)性尚未見報(bào)道。因此，擬對(duì)不同階段的慢性HBV感染者肝臟組織和外周血MANF mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行研究，探討MANF在乙型肝炎－肝纖維化－肝硬化進(jìn)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2012年1月～3月在中國(guó)人民解放軍123醫(yī)院住院并行肝臟穿刺活檢的慢性HBV感染患者20例進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，其中G1S1、G2S2、G3S3、G4S4各5例，男12例，女8例，年齡25～54（33.7±12.4）歲，分別作為G1S1組、G2S2組、G3S3組及G4S4組。選取2013年5月～2014年3月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科的乙肝表面抗原攜帶者（asymptomatic hepatitis B virus surface antigen carriers，ASC）44例作為ASC組，慢乙肝（chronic hepatitis B，CHB）患者56例作為CHB組，乙肝后肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者49例作為L(zhǎng)C組，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究，同時(shí)選取40例體檢健康者（normal healthy controls，NC）作為NC組。所有病例無(wú)重疊其他肝炎病毒感染、藥物性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病及其他疾病。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 病理組織檢查采用1 s快速穿刺活檢術(shù)獲取長(zhǎng)度在1.5～2.0 cm的肝臟組織，按以下步驟處理樣本：4%的甲醛固定，乙醇溶液脫水，石蠟包埋，組織切片，HE及網(wǎng)狀纖維染色。在光學(xué)顯微鏡下（×200）多視野觀察，病理分級(jí)參照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》［6］。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究肝穿組織先經(jīng)胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解為肽段，得到的肽段用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，ITRAQ）試劑進(jìn)行差異標(biāo)記，再將標(biāo)記樣本相混合，最后用液相－二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）設(shè)備進(jìn)行分析，具體委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.4 免疫組化法石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用0.1 mol／L檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。4℃條件下用5%的山羊血清進(jìn)行封閉，加一抗（1∶200的MANF抗體，英國(guó)Abcam公司）后4℃過(guò)夜。滴加生物素化二抗（B液）37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化結(jié)果判斷顯微鏡下觀察肝臟組織，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)褐色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行半定量分析［7］，二者綜合后評(píng)定結(jié)果：陰性，弱陽(yáng)性，陽(yáng)性，強(qiáng)陽(yáng)性。見圖1。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采集HBV感染者及健康體檢者的空腹外周血1 ml，4 h內(nèi)加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后離心棄上清液留白細(xì)胞沉淀，加入TRIzol混勻后按照說(shuō)明書提取RNA。1%的瓊脂糖電泳鑒定RNA。RNA的濃度及純度用分光測(cè)量?jī)xQuawell Q5000測(cè)定。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照TaKaRa PrimScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，總體系為10 μl，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃15 s。按照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的MANF、GAPDH基因序列，用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)人源引物，委托上海生工公司合成引物，GAPDH引物：上游5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′；MANF引物：上游5′-TCACATTCTCACCAGCCACT-3′，下游5′-CAGGTCGATCTGCTTGTCATAC-3′。按照SYBR Green PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書使用PR0961201846（美國(guó)Thermo公司）實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95℃30 s預(yù)變性→（95℃5 s→60℃30 s），40個(gè)循環(huán)。1%的瓊脂糖電泳鑒定目的基因片段，GAPDH作為內(nèi)參，使用2－ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。定量資料進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用秩和檢驗(yàn)，分類資料采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。診斷分組之間的兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.008 3和P＜0.008 3差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05和P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝穿組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果在對(duì)不同炎癥和纖維化分級(jí)的慢性乙型肝炎患者肝穿組織各5例進(jìn)行ITRAQ蛋白組學(xué)定量研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著肝臟炎癥纖維化加劇，MANF蛋白的表達(dá)逐步增加，與肝臟炎癥和纖維化程度呈密切正相關(guān)。

2.2 肝穿標(biāo)本中MANF蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果

為了進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)的初步發(fā)現(xiàn)，再次對(duì)上述標(biāo)本的石蠟切片進(jìn)行了MANF蛋白表達(dá)的免疫組化驗(yàn)證，結(jié)果顯示G1S1組多呈陰性及弱陽(yáng)性表達(dá)，G2S2組多呈弱陽(yáng)性及陽(yáng)性表達(dá)，G3S3及G4S4組多呈陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果一致。

2.3 不同階段的慢性HBV感染患者外周血MANF mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示：4組之間MANF mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.00）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間分析顯示，與LC組相比，NC組、ASC組和CHB組MANF mRNA的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其余任意兩組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。采用秩相關(guān)檢驗(yàn)示外周血白細(xì)胞中MANF mRNA表達(dá)與肝臟疾病進(jìn)展存在正相關(guān)（rs＝0.376，P＝0.00）。

2.4 外周血白細(xì)胞MANF mRNA的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性將149例HBV感染者根據(jù)乙肝病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）水平、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平、乙肝病毒e抗原（hepatitis B e-antigen，HBeAg）定性、HBV-DNA以及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平分別進(jìn)行分組，結(jié)果表明，MANF mRNA的表達(dá)水平在不同水平的HBsAg分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.043），但任意兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HBeAg陽(yáng)性組與陰性組外周血白細(xì)胞MANF mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001）；TBIL正常組與異常組之間MANF mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001）；但MANF mRNA表達(dá)水平在不同ALT、AST和HBV-DNA分組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

3 討論

MANF基因是從30 000個(gè)基因中篩選出來(lái)的并對(duì)ER應(yīng)激最敏感的基因，是一種分泌性蛋白。課題組在前期研究［8］已經(jīng)證實(shí)，MANF蛋白是一種ER應(yīng)激相關(guān)的分泌性蛋白，ER應(yīng)激上調(diào)MANF表達(dá)。而大量研究［13－14］已經(jīng)證實(shí)，HBV持續(xù)感染可以導(dǎo)致ER應(yīng)激，對(duì)MANF蛋白是否參與HBV慢性感染后肝臟炎癥和纖維化進(jìn)展尚未見報(bào)道。推測(cè)，MANF很可能在肝炎到肝硬化的轉(zhuǎn)變中起著重要的作用。因此，首先選取了不同炎癥和纖維化分級(jí)的肝臟穿刺組織進(jìn)行ITRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)的探索性研究，結(jié)果顯示，MANF隨炎癥和纖維化的加重而表達(dá)逐步增加，提示MANF蛋白參與了肝臟炎癥和纖維化的進(jìn)展。為進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)的初步結(jié)果，再次對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的肝臟穿刺石蠟標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化研究，結(jié)果同樣證實(shí)MANF蛋白的表達(dá)隨著炎癥和纖維化程度的加重逐漸增加。目前認(rèn)為，ER應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡、炎癥和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作為一種刺激因素參與了組織損傷和纖維化的發(fā)生發(fā)展［9］。未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）反應(yīng)誘導(dǎo)的凋亡可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）的釋放，進(jìn)一步刺激纖維化的發(fā)生發(fā)展［10］。結(jié)合前期體外研究［11］證實(shí)MANF對(duì)ER應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。另外，通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)HBx蛋白的人肝癌細(xì)胞株HepG2研究［12］表明，糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78／BiP）和MANF在穩(wěn)轉(zhuǎn)HBx蛋白的HepG2細(xì)胞中表達(dá)升高，這一結(jié)論從理論上支持以上觀點(diǎn)。MANF在多種疾病中可以保護(hù)相關(guān)細(xì)胞免受損傷，推測(cè)MANF蛋白在HBV感染后疾病進(jìn)程中可能起著保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷，其在肝硬化中的高表達(dá)很可能是機(jī)體抗纖維化的一個(gè)自我保護(hù)反應(yīng)，當(dāng)然也不能排除MANF本身就是一個(gè)肝纖維化的標(biāo)志或促肝纖維化的指標(biāo)，有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

HBV病毒本身，HBV相關(guān)蛋白及病程中產(chǎn)生的炎癥及氧化應(yīng)激均可觸發(fā)ER應(yīng)激［13－14］。ER應(yīng)激蛋白CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）很可能通過(guò)上調(diào)TGF-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白及膠原蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝纖維化［15］。研究［14］證實(shí)：HBsAg在肝細(xì)胞內(nèi)的聚集均會(huì)誘發(fā)ER應(yīng)激，鑒于MANF蛋白是一種分泌性蛋白，因此，對(duì)不同階段的慢乙肝患者外周血MANF mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果表明，MANF mRNA水平隨著疾病進(jìn)展表達(dá)逐漸增加，也同樣支持MANF蛋白參與了肝纖維化進(jìn)展。臨床證據(jù)顯示HBsAg和HBV DNA水平越高的患者，肝纖維化程度相對(duì)較低，研究也證實(shí)MANF蛋白隨著HBsAg和HBV DNA水平的增高而表達(dá)逐步降低。本研究表明HBeAg陽(yáng)性組與陰性組間MANF mRNA的表達(dá)存在差異，且陽(yáng)性組MANF mRNA的表達(dá)量要高于陰性組，這可能與HBeAg陽(yáng)性者肝臟受損較重，所誘導(dǎo)的ER應(yīng)激也越激烈，從而導(dǎo)致MANF的高表達(dá)，而這種高表達(dá)可能是為了減輕肝細(xì)胞炎癥及纖維化。膽紅素是反映肝功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，HBV感染者可因?yàn)楦渭?xì)胞的損傷引起膽紅素的升高，其持續(xù)的升高往往提示肝臟損傷也在持續(xù)的加重，即可以發(fā)生嚴(yán)重的ER應(yīng)激，最終導(dǎo)致ER應(yīng)激相關(guān)基因MANF的高表達(dá)。這可以解釋TBIL異常組MANF mRNA的表達(dá)量要高于與TBIL正常組。一般而言，轉(zhuǎn)氨酶水平越高，肝細(xì)胞受損越重，但研究卻未發(fā)現(xiàn)外周血中MANF mRNA的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)氨酶水平存在相關(guān)性，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)MANF蛋白參與了肝臟炎癥和纖維化的進(jìn)展，但確切的機(jī)制尚不明確，推測(cè)MANF蛋白可能起到對(duì)抗促肝纖維化機(jī)制的作用，MANF蛋白作為一種分泌性蛋白有可能作為一個(gè)監(jiān)測(cè)肝纖維化的潛在指標(biāo)，進(jìn)一步闡明MANF蛋白的作用機(jī)制有待進(jìn)一步通過(guò)改變MANF蛋白表達(dá)量來(lái)觀察肝纖維化程度的改變程度來(lái)明確。

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Study on correlation between MANF expression levels and the grade of liver fibrosis

Pan Gaofeng，Gao Yufeng，Ye Jiaojiao，et al
（Dept of Hepatopathy，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo explore the role of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor（MANF）protein in the development of liver fibrosis and clinical significance in the patients with chronic hepatitis B virus（HBV）infection.MethodsThe expression of MANF protein in liver biopsy tissues was detected by isobaric tags for relative and absolute quantitation（ITRAQ）and immunohistochemical method，and then the relationship of MANF expression and the degree of inflammation and fibrosis of liver were analyzed.The levels of MANF mRNA in peripheral leukocytes were measured by real-time polymerase chain reaction（PCR），and analyzed its correlation between clinical virological and biochemical data in asymptomatic hepatitis B virus surface antigen carriers（ASC），chronic hepatitis B（CHB），and liver cirrhosis（LC）.ResultsMANF protein was mainly localized in the cytoplasm of liver cells.The expression levels of MANF were gradually increased with the aggressive inflammation and fibrosis of liver.The expression levels of MANF mRNA in the patients with NC，ASC，CHB had a statistically significant difference compared to LC，respectively（P＜0.01）.The expression levels of MANF mRNA had a statistically significant difference among three hepatitis B virus surface antigen（HBsAg）levels groups（HBsAg＜1.5×106IU／L，1.5× 106IU／L～2.0×107IU／L and＞2.0×107IU／L，P＜0.05）.The difference of MANF mRNA expression levels was statistical significance between hepatitis B e-antigen（HBeAg）-positive group and HBeAg-negative group（P＜0.01），between normal and abnormal bilirubin group（P＜0.01）.ConclusionFor the patients with HBV infection，MANF protein may be involved in the development of liver fibrosis and assciated with its clinical significance.

MANF；endoplasmic reticulum stress；chronic hepatitis B；liver fibrosis

R 34

1000－1492（2015）01－0078－05

2014－09－27接收

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2014A107）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科，合肥 2306012安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，合肥 230032

潘高峰，男，碩士研究生；郜玉峰，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aygyf＠126.com