趙 皓，余 晾，張敬星，陳月娟，呂合作，，王保龍

鞘堿性蛋白活化的SD大鼠T細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

趙 皓1，2，余 晾2，張敬星3，陳月娟3，呂合作2，3，王保龍1

目的培養(yǎng)針對髓鞘堿性蛋白（MBP）特異的SD大鼠T淋巴細(xì)胞，對其表型和細(xì)胞因子分泌特征進(jìn)行鑒定。方法將MBP免疫SD大鼠，收集回流淋巴結(jié)，制備成單細(xì)胞懸液，在RMPI 1640培養(yǎng)液中用MBP反復(fù)刺激獲得MBP特異性T細(xì)胞（MBP-T）。然后用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法測定其對MBP刺激的反應(yīng)性，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表型和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。結(jié)果當(dāng)MBP抗原存在的情況下，MBP-T的3H-TdR摻入量明顯增加。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明MBP-T主要為CD3＋CD4＋的T淋巴細(xì)胞（98%），并可以產(chǎn)生干擾素γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素10（IL-10）等細(xì)胞因子。結(jié)論MBP免疫SD大鼠的回流淋巴結(jié)細(xì)胞，經(jīng)過體外擴(kuò)增可以獲得MBP特異性的T細(xì)胞，其表型主要為CD3＋CD4＋，并可以產(chǎn)生Th1和Tr1型細(xì)胞因子。

髓鞘堿性蛋白；淋巴細(xì)胞；免疫；流式細(xì)胞術(shù)

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）是一個免疫豁免區(qū)，CNS抗原如髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）與免疫系統(tǒng)在解剖學(xué)上處于隔離狀態(tài)，被稱為隱蔽抗原［1－2］。因而，長期以來一直認(rèn)為CNS損傷后的自身免疫反應(yīng)會加重繼發(fā)性損害，不利于神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生［3－4］。然而，以色列Schwartz et al［5］研究小組卻提出CNS“保護(hù)性自身免疫”學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為CNS損傷后的自身免疫反應(yīng)除具有加重繼發(fā)性損傷的負(fù)面作用外，也具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的積極作用，只是在自然狀態(tài)下，這種作用過于微弱，被其負(fù)面作用壓制而難以表現(xiàn)。采用一些免疫干預(yù)的手段，如用體外擴(kuò)增的MBP特異性T細(xì)胞（myelin basic protein specific T cells，MBP-T）進(jìn)行過繼免疫則可以激發(fā)這種神經(jīng)保護(hù)作用［6］。因此，該研究擬采用MBP免疫SD大鼠，獲取回流淋巴結(jié)，再通過反復(fù)刺激的方法體外擴(kuò)增MBP特異的T細(xì)胞，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表型和細(xì)胞因子分泌特征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物5只健康成年清潔級SD大鼠，220～250 g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物實(shí)驗(yàn)和護(hù)理均按照美國國家研究委員會1996年制定的《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》及蚌埠醫(yī)學(xué)院動物保護(hù)和使用委員會制定的《嚙齒動物生存手術(shù)的方針政策》執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器完全福氏佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA）（美國BBI公司）；MBP、刀豆蛋白A（concanavalin A，conA）、絲裂霉素C、多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、Monesion（美國Sigma公司）；RMPI 1640（美國Gibco公司）；谷氨酰胺、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二巰基乙醇、丙酮酸鈉（中國華美公司）；慶大霉素（上海中西制藥有限公司）；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（上海試劑二廠）；復(fù)方泛影葡胺（上?；春Ｖ扑帍S）；重組人IL-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）（長春長生基因藥業(yè)公司）；100×Glutamine、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、漢克斯平衡鹽溶液（hank′s balanced salt solution，HBSS）（Ca2＋，Mg2＋free）（美國Invitrogen公司）；3H-胸腺嘧啶（3H-thymidine，3H-TdR）（北京原子能股份有限公司）；戊巴比妥鈉（上?；瘜W(xué)試劑采供站進(jìn)口分裝）；FITC標(biāo)記的CD3單克隆抗體（FITC conjugated anti-CD3 mAb，CD3-FITC）、PE標(biāo)記的CD4單克隆抗體（PE conjugated anti-CD4 mAb，CD4-PE）、APC標(biāo)記的CD8單克隆抗體（APC conjugated anti-CD8 mAb，CD8-APC）（美國Caltag laboratories）；FITC標(biāo)記的IFN-γ抗體（FITC conjugated anti-IFN-γ，IFN-γ-FITC）（美國Harlan公司）；PE標(biāo)記的IL-10抗體（PE conjugated anti-IL-10，IL-10-PE）、FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；eFluor?660標(biāo)記的IL-4抗體（eFluor?660 conjugated anti-IL-4，IL-4-eFluor?660）（美國eBioscience公司）。

1.3 MBP-T的培養(yǎng)與擴(kuò)增將MBP溶于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配成1 mg／ml的濃度，與等量的CFA（4 mg／ml熱滅活的結(jié)核桿菌）混合，置2只注射器中來回抽推制成MBP／CFA油包水乳劑，4℃保存?zhèn)溆谩?.2 ml MBP／CFA乳劑注射于SD大鼠雙側(cè)后足跖真皮內(nèi)進(jìn)行免疫。免疫9 d后，無菌取大鼠腹股溝淋巴結(jié)，制備成單細(xì)胞懸液，用RMPI 1640洗2次后，用刺激培養(yǎng)基（RMPI 1640添加L-谷氨酰胺2 mmol／L、二巰基乙醇50 μmol／L、丙酮酸鈉1 mmol／L、Hepes 10 mmol／L、慶大霉素50 000 IU和體積分?jǐn)?shù)為2%的同基因SD大鼠血清）調(diào)細(xì)胞濃度至1×107／ml，加MBP（25 mg／L）于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，刺激MBP特異的T細(xì)胞，使之活化。培養(yǎng)3 d后，收集細(xì)胞，室溫離心（1 000 r／min，10 min）取沉淀，用2 ml RMPI 1640液重懸細(xì)胞。用3 ml Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（用泛影葡胺調(diào)密度至1.088）于1 500 r／min離心30 min后分離活化的T細(xì)胞母細(xì)胞。用增殖培養(yǎng)基（RMPI 1640添加2 mmol／L L-谷氨酰胺、50 μmol／L二巰基乙醇、1 mmol／L丙酮酸鈉、10 mmol／L Hepes、50 000 IU慶大霉素、2%的同基因SD大鼠血清、8%FBS和50 U／ml rhIL-2）調(diào)細(xì)胞密度至1× 106／ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后，用增殖培養(yǎng)基調(diào)T細(xì)胞濃度至1×106／ml，與1 ×107／ml同基因SD大鼠絲裂霉素C（50 μg／ml，37℃孵育30 min）處理的脾細(xì)胞懸液（作為抗原遞呈細(xì)胞）及MBP（25 mg／L）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。2～3 d后，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離活化的T細(xì)胞，再以增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增5～7 d。在T細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，當(dāng)T細(xì)胞開始變小，并不再增殖時，則用MBP再次刺激T細(xì)胞活化、培養(yǎng)擴(kuò)增。如此反復(fù)，經(jīng)過3個活化、擴(kuò)增循環(huán)后，便可得到足夠數(shù)量的MBP-T細(xì)胞。

1.4 淋巴細(xì)胞增殖分析將MBP-T細(xì)胞用不含rhIL-2的增殖培養(yǎng)基調(diào)整為2×106／ml濃度，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計分組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別取100 μl加入到96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為2×105個細(xì)胞／孔，同時在每孔中均加入2×106個絲裂霉素C處理的脾細(xì)胞作為抗原遞呈細(xì)胞。然后在每孔中加入25 μg／ml MBP（MBP刺激組）或25 μg／ml BSA（BSA對照組），以及只加培養(yǎng)基（陰性對照組）。最后，各組添加不含rhIL-2增殖培養(yǎng)基至終體積為200 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，加入3.7× 10－5GBq／well的3H-TdR，再進(jìn)一步培養(yǎng)18 h，用多頭收集儀將細(xì)胞收集到玻璃纖維膜上，并用β液體閃爍計數(shù)儀測定細(xì)胞摻入的放射性強(qiáng)度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)志染色：將待測細(xì)胞用冰冷PBS洗滌后，用染色緩沖液（含5%FBS、0.1%NaN3的PBS）配制成2×106／ml的細(xì)胞懸液。在離心管中預(yù)先加入熒光素標(biāo)記抗體：CD3-FITC（1 μg／106細(xì)胞）、CD4-PE（0.25 μg／106細(xì)胞）和CD8-APC（0.2 μg／106細(xì)胞）；同時設(shè)立不加抗體的空白對照管。每管加細(xì)胞懸液50 μl置室溫20 min，然后用PBS離心洗滌2次，最后加含1%PFA的PBS 0.4 ml固定。胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：將1×106MBP-T細(xì)胞培養(yǎng)于不含rhIL-2的增殖培養(yǎng)基中，分別添加25 μg／ml MBP（MBP刺激組）、25 μg／ml BSA（BSA對照組），同時設(shè)立只加培養(yǎng)基的陰性對照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入monesion至終濃度2 μmol／L，用于阻滯細(xì)胞因子蛋白分泌，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后收集細(xì)胞用于檢測。用PBS洗滌細(xì)胞后，加2%PFA 400 μl，4℃避光30 min以上以固定細(xì)胞。然后，用染色緩沖液（1 ml／管）4℃1 000 r／min離心5 min洗細(xì)胞1次，加400 μl透膜緩沖液（含0.1%Saponin-5%FBS的PBS）4℃避光透膜15 min，離心棄上清液，同時加入細(xì)胞因子抗體：IFN-γ-FITC（1 μg／106細(xì)胞）、IL-10-PE（1 μg／106細(xì)胞）和IL-4-eFluor?660（1 μg／106細(xì)胞），4℃避免孵育30 min。每管加透膜緩沖液1 ml，4℃、1 000 r／min離心5 min，洗2次，加1%PFA 400 μl固定。用FACS Calibur流式細(xì)胞儀Cellquest軟件檢測待檢樣品，所得數(shù)據(jù)文件用Cellquest或WinMDI 2.9軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，3組數(shù)據(jù)之間的比較采用方差分析和q檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 MBP-T細(xì)胞的表型特征 MBP免疫9 d后，在新鮮分離的淋巴結(jié)細(xì)胞（lymph node cells，LNC）中，CD3＋細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比為（59.98± 7.16）%，在CD3＋細(xì)胞中CD3＋CD4＋的細(xì)胞為（74.78±8.77）%，CD3＋CD8＋的細(xì)胞為（20.21± 2.78）%。經(jīng)過體外3個循環(huán)的刺激、擴(kuò)增后，MBP活化擴(kuò)增的細(xì)胞主要為CD3＋的T淋巴細(xì)胞（98.62 ±0.71）%，在CD3＋細(xì)胞中CD3＋CD4＋的細(xì)胞占絕大多數(shù)，為（97.29±1.44）%，而CD3＋CD8＋的細(xì)胞則非常少，其比例僅為（1.70±1.23）%。MBP活化擴(kuò)增的細(xì)胞與新鮮分離的LNC比較，其CD3＋細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例和CD3＋細(xì)胞中CD4＋細(xì)胞的比例均明顯升高，而其CD8＋細(xì)胞的比例則明顯降低，各指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，t＝12.01、5.66、13.62）。見圖1。

2.2 MBP抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖分析在陰性對照組和BSA對照組，所有的細(xì)胞均沒有明顯的增殖反應(yīng)，其3H-TdR摻入量分別為（655.40±171.86）cpm和（677.20±220.97）cpm，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)存在25 μg／ml MBP的情況下，MBP-T細(xì)胞的3H-TdR摻入量明顯增高，達(dá)（14 094.80± 3 300.75）cpm，與陰性對照組和BSA對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，F(xiàn)＝82.16）。

2.3 MBP-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的特征流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測表明：在陰性對照組和BSA對照組，MBP-T細(xì)胞中均幾乎檢測不到IFN-γ、IL-10和IL-4的表達(dá)。在陰性對照組中，三者表達(dá)的陽性細(xì)胞僅分別為（1.13±0.63）%、（0.76±0.24）%和（0.59±0.16）%；在BSA對照組中，三者表達(dá)的陽性細(xì)胞也僅分別為（1.30±0.55）%、（0.95± 0.47）%和（0.64±0.19）%。3種因子的表達(dá)率在兩組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。用MBP刺激后，IFN-γ和IL-10表達(dá)的陽性細(xì)胞則明顯增加，分別為（28.08±6.85）%和（14.67±5.52）%，與陰性對照組和BSA對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。但是，仍幾乎檢測不到IL-4的表達(dá)，其比例僅為（0.69±0.36）%，與陰性對照組和BSA對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝75.86、31.02、0.159）。見圖2。

3 討論

CNS損傷后，由于損傷部位組織細(xì)胞的壞死和凋亡，CNS抗原能夠釋放出來，激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，包括損傷局部小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，外周單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的浸潤。隨后，CNS抗原可以被活化的小膠質(zhì)細(xì)胞或單核巨噬細(xì)胞加工遞呈給相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞，使之活化，從而產(chǎn)生針對自身CNS抗原反應(yīng)的T細(xì)胞群體［7］。雖然目前對自身反應(yīng)性T細(xì)胞對在CNS損害后的作用仍存在爭議，但是其參與CNS損傷與修復(fù)的過程是毋容置疑的［8］。在這些CNS自身反應(yīng)性T細(xì)胞中，MBP活化的T細(xì)胞倍受研究者關(guān)注，因此對于該細(xì)胞在CNS損傷修復(fù)中的爭議也很多［9－11］。

在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究［12］中，通過MBP免疫EAE敏感的動物（如Lewis大鼠）是建立EAE模型的經(jīng)典方法。采用MBP主動免疫這些動物品系能夠誘導(dǎo)典型的EAE表現(xiàn)，也可以通過體外擴(kuò)增的方法獲得MBP特異的T細(xì)胞。但是，這些細(xì)胞在隨后的過繼免疫治療研究［10］中常常會出現(xiàn)中樞神經(jīng)損害性的結(jié)果。為了盡量減少過繼免疫誘發(fā)的EAE癥狀對評價自身免疫保護(hù)效應(yīng)的干擾，本研究在前期的實(shí)驗(yàn)中采用SD大鼠［9］。與EAE-敏感的Lewis rat大鼠不同，SD大鼠是EAE-抵抗種系，結(jié)果表明MBP-T細(xì)胞過繼免疫同種系的SD大鼠可以激發(fā)中樞神經(jīng)保護(hù)作用［9］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定這類細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子分泌特征，以期為目前存在的爭議提供可能的解釋。

研究顯示，在新鮮分離的LNC中，CD3＋細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)約60%，其中CD3＋CD4＋的細(xì)胞約為75%，而CD3＋CD8＋的細(xì)胞約為20%。經(jīng)過體外3個循環(huán)的刺激、擴(kuò)增后，MBP活化擴(kuò)增的細(xì)胞主要為CD3＋的T淋巴細(xì)胞，且CD3＋CD4＋的細(xì)胞占絕大多數(shù)（98%），與文獻(xiàn)［9，13］報道一致。3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)表明這種細(xì)胞是MBP特異性的。根據(jù)分泌細(xì)胞因子種類的不同，分化的CD4＋Th細(xì)胞可分為Th1、Th2、Th3和Tr1等細(xì)胞亞群。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2和IFN-γ，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2主要分泌IL-4和IL-5，主要介導(dǎo)體液免疫；Tr1／Th3主要分泌IL-10／TGF-β，對免疫系統(tǒng)的功能具有抑制性調(diào)節(jié)作用［14－15］。本研究顯示MBP-T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ和IL-10，卻沒有檢測到IL-4，這說明在MBP-T細(xì)胞中除了Th1細(xì)胞存在外，還有一定比例的具有免疫抑制調(diào)節(jié)作用的Tr1細(xì)胞亞型，這類細(xì)胞在CNS免疫反應(yīng)過程中可能具有特有的調(diào)節(jié)功能（如調(diào)節(jié)損傷局部巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞的活化），從而影響CNS損傷的最終結(jié)局。

綜上所述，用MBP免疫SD大鼠，經(jīng)過體外擴(kuò)增可以獲得MBP特異性的T細(xì)胞，其表型主要為CD3＋CD4＋，并可以按照細(xì)胞因子的產(chǎn)生區(qū)分為Th1和Tr1亞型。

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Culture and identification of myelin basic protein activated T cells in SD rats

Zhao Hao1，2，Yu Liang2，Zhang Jingxing3，et al

（1Dept of Medical Laboratory，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
2Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004；
3Anhui Provincial Key Laboratory of Tissue Transplantation，Bengbu 233030）

ObjectiveTo culture the myelin basic protein（MBP）specific T lymphocytes in SD rats，and identify their characterization of phenotype and cytokine profiles.MethodsThe SD rats were immunized with MBP；the draining lymph nodes were collected and made into single cell suspension.The cells were cultured in RMPI 1640 medium and stimulated repeatedly with MBP to produce MBP specific T（MBP-T）cells.Then，their reactivity to MBP stimulation was measured using3H-thymidine（3H-TdR）incorporation，the phenotype and cytokine profiles were determined using flow cytometry.ResultsWhen the MBP antigen exists，3H-TdR incorporation of MBP-T cells increased obviously.Flow cytometry showed that MBP-T cells were mainly CD3＋CD4＋T lymphocytes（98%），and could produce interferon-γ（IFN-γ）and interleukin-10（IL-10）.Conclusion The cells collected from the draining lymph nodes of MBP immunized SD rats could be amplified into MBP-T cells in vitro.The phenotypes of these cells are mainly CD3＋CD4＋，and show the Th1 and Tr1 cytokine profiles.

myelin basic protein；lymphocytes；immunity；flow cytometry

R 392.12

A

1000－1492（2015）

2014－09－23接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81071268、81271363）

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001

2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 2330043組織移植安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 233030

趙 皓，男，主管檢驗(yàn)師，碩士研究生；

王保龍，男，教授，主任檢驗(yàn)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wbl196555＠163.com