王 璟，陳 靜，沈 韻，吳松濤，黃稔歡，王飛宇，賴文莉

一個(gè)先天缺牙家系的基因突變及病例對(duì)照研究

王 璟1，2，陳 靜2，3，沈 韻1，吳松濤2，黃稔歡2，王飛宇2，賴文莉

目的探討非綜合征型多數(shù)牙先天缺失患者的人類成對(duì)盒基因9（PAX9）、同源盒基因1（MSX1）、中軸抑制蛋白2（AXIN2）突變位點(diǎn)，為該疾病的病因?qū)W研究提供依據(jù)。方法對(duì)該例患者及其家庭成員進(jìn)行全身系統(tǒng)檢查、口腔?？茩z查（含拍攝曲面斷層片）及家系調(diào)查；抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增PAX9基因的外顯子1、2、3、4，MSX1基因外顯子1、2及AXIN2基因外顯子2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，通過(guò)對(duì)分段PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并結(jié)合系譜圖進(jìn)行基因突變分析。同時(shí)，通過(guò)病例－對(duì)照實(shí)驗(yàn)（先天缺牙組50例，健康對(duì)照組100例）對(duì)突變位點(diǎn)AXIN2G1807C與先天缺牙的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果先證者的祖母和外祖父為兄妹關(guān)系?？趦?nèi)檢查以及曲面斷層片發(fā)現(xiàn)先證者為無(wú)牙牙合，僅見(jiàn)左側(cè)下頜升支處有一阻生牙影像，其余家庭成員牙齒數(shù)目發(fā)育正常。均未合并其他組織器官的先天發(fā)育異常。先證者及部分表型正常者分別發(fā)現(xiàn)3個(gè)已知突變位點(diǎn)，分別為AXIN2外顯子6第1 365位A變?yōu)镚（rs9915936），外顯子7第1 807位G變?yōu)镃（rs145353986）以及外顯子8第2 062位C變?yōu)門（p. Leu688Leu）。PAX9、MSX1未見(jiàn)異常。病例組和對(duì)照組間AXIN2G1807C的基因頻率和基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論AXIN2c.2062C＞T突變可能是導(dǎo)致中國(guó)人群非綜合征型多數(shù)牙缺失的危險(xiǎn)因素之一。AXIN2c.1807G＞C與此類疾病之間不存在明顯的相關(guān)性。

非綜合征型先天缺牙；成對(duì)盒基因9；肌節(jié)同源盒基因1；中軸抑制蛋白2

先天缺牙是臨床常見(jiàn)的發(fā)育異常性疾病之一，目前病因尚不明確。多數(shù)研究［1－4］認(rèn)為先天缺牙是由遺傳和環(huán)境等多因素共同作用所致，其中遺傳因素起主導(dǎo)作用?，F(xiàn)階段先天性缺牙的遺傳學(xué)研究大多集中于對(duì)候選基因的突變篩選，成對(duì)盒基因（paired box 9，PAX9）、肌節(jié)同源盒基因（muscle segment homeoboxgene1，MSX1）、中軸抑制蛋白（axis inhibition protein 2，AXIN2）是目前較為公認(rèn)的與先天缺牙有關(guān)的候選基因［5］?；蛐停硇瓦z傳分析認(rèn)為，MSX1基因突變?cè)斐闪舜蠖鄶?shù)前磨牙和第三磨牙的先天缺失，而PAX9基因突變主要影響磨牙的發(fā)育［5－7］。為了探討中國(guó)先天缺牙患者表型與基因型的關(guān)系，現(xiàn)對(duì)一個(gè)特殊的先天缺牙家系進(jìn)行了臨床及MSX1、PAX9和AXIN2基因突變分析，并通過(guò)病例－對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料及背景調(diào)查該研究由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2009022）。所有志愿者均為漢族人，來(lái)自中國(guó)成都及其周邊地區(qū)，充分了解本研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書(shū)。先證者及其家庭成員調(diào)查：先證者（Ⅳ-2）因全口牙齒缺失于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院就診。通過(guò)多次家訪求證，收集先證者及其家系成員的詳細(xì)資料并繪制系譜圖。對(duì)先證者及其家庭成員進(jìn)行詳細(xì)全身系統(tǒng)檢查、口腔?？茩z查并記錄相關(guān)病史，包括頭發(fā)、指甲、皮膚、汗腺等外胚葉來(lái)源組織的檢查以及口腔曲面斷層片檢查。病例－對(duì)照試驗(yàn)：征集2009年10月～2011年11月于四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院就診患者及健康志愿者，共納入單純性牙缺失患者50例和健康志愿者100例，對(duì)其進(jìn)行全面的口腔?？茩z查，包括拍攝口腔曲面斷層片。同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的全身系統(tǒng)檢查，包括頭發(fā)、指甲、皮膚、汗腺等外胚葉來(lái)源組織的檢查，并記錄相關(guān)病史。

1.2 基因篩查

1.2.1 樣本采集及DNA提取 分別抽取志愿者外周靜脈血各5 ml，加入1 ml ACD（1.32%檸檬酸鈉，0.48%檸檬酸，1.47%葡萄糖）抗凝，采用酚－氯仿抽提法提取基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)MSX1、PAX9和AXIN2在NCBI GenBank中的全序列設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增PAX9基因第1～4外顯子［8］、MSX1基因第1、2外顯子［8］以及AXIN2基因第2～11外顯子［8］，引物均由上海生工生物工程有限公司采用Oligo Primer Analysis Software合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增目的片段 反應(yīng)總體積為50 μl，其中加入10×反應(yīng)緩沖液（MgCl2濃度為2 mmol／L）5 μl、基因組DNA約3 μl、TaqDNA聚合酶（TaKaRa Biotechnology，Dallian China）2.5 U，使dNTP終濃度達(dá)到0.3 μmol／L，上下游引物的終濃度均達(dá)到0.3 mol／μl。循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：94℃變性5 min，94℃0.5 min，56℃0.5 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。全部PCR產(chǎn)物均經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化及DNA測(cè)序 電泳分離PCR產(chǎn)物，切取DNA條帶，使條帶的相對(duì)分子量為預(yù)期大小，采用膠回收試劑盒回收該條帶，除去PCR引物、酶及其他雜質(zhì)，得到純化的PCR產(chǎn)物。利用BigDye四色熒光測(cè)序反應(yīng)試劑盒（BigDye Terminator Kit），以所得的純化PCR產(chǎn)物為模板在9600型PCR儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：98℃變性120 s，96℃10 s，50℃5 s，60℃120 s，25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用ABI PRISM 310型全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定，其測(cè)序結(jié)果采用DNAstar軟件進(jìn)行編輯、比較。

1.2.5 突變分析和蛋白預(yù)測(cè) 在NCBI GenBank上將所得的測(cè)序結(jié)果與人類基因組PAX9、MSX1、AXIN2基因序列進(jìn)行同源序列比較，并參照系譜圖進(jìn)行基因突變分析（GenBank accession：PAX9，NC_ 000014.837126773－37147012；MSX1，NG_008121. 1；AXIN2，NG_012142.1）。三維蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)AXIN2G1807C所引起的蛋白構(gòu)象的改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用χ2檢驗(yàn)分析AXIN2G1807C突變位點(diǎn)基因頻率和基因型在病例組和對(duì)照組之間的差異（SPSS 17.0，IBM，New York，NY，USA）。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果先證者家族中無(wú)先天缺牙病史及結(jié)腸癌史，其祖母及外祖父為兄妹關(guān)系，見(jiàn)圖1 A?？趦?nèi)檢查及曲面斷層片結(jié)果顯示：先證者（Ⅳ－2）為無(wú)牙牙合，僅見(jiàn)左側(cè)下頜升支處有一阻生牙，患者口內(nèi)及X-RAY影像見(jiàn)圖1B、1C。追問(wèn)病史，患兒家長(zhǎng)述乳牙期存在相同部位牙缺失，既往無(wú)外傷及疾病史，有近親婚配史，無(wú)遺傳史。其余家庭成員牙齒數(shù)目發(fā)育正常，無(wú)類似病史。均未合并口面裂、皮膚及其附屬組織、毛發(fā)等其他組織器官的先天發(fā)育異常。

2.2 基因篩查及蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果先證者（Ⅳ-2）及部分表型正常者分別發(fā)現(xiàn)3個(gè)已知突變位點(diǎn)，分別為AXIN2外顯子6第1 365位A變?yōu)镚（rs9915936），見(jiàn)圖2。外顯子7第1 807位G變?yōu)镃（rs145353986），見(jiàn)圖3、4。外顯子8第2 062位C變?yōu)門（p.Leu688Leu），見(jiàn)圖5。PAX9、MSX1未見(jiàn)異常。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，外顯子7第1 807位G變?yōu)镃（rs145353986）后所對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)相較于正常蛋白結(jié)構(gòu)存在差異，見(jiàn)圖6。

2.3 AXIN2G1807C與先天缺牙的相關(guān)性分析AXIN2G1807C基因頻率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.107，P＝0.743）。同時(shí)，AXIN2G1807C基因型頻率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.571，P＝0.804）。

3 討論

在AXIN2測(cè)序結(jié)果中，本研究檢測(cè)到先證者（Ⅳ-2）存在3個(gè)已知突變，分別為外顯子6第1 365位A變?yōu)镚（rs9915936），外顯子7第1 807位G變?yōu)镃（rs145353986），外顯子8第2 062位C變?yōu)門（p.Leu688Leu）。

作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，AXIN2調(diào)控胚胎的發(fā)育和組織的形成。前期有關(guān)牙發(fā)育的分子研究［9］證實(shí)在牙發(fā)育過(guò)程中有大量的Wnt基因的表達(dá)，其表達(dá)的變化與否影響牙的發(fā)育。AXIN2c.1365A＞G（rs9915936）分布于正常人群中，與多數(shù)牙缺失的相關(guān)性不大。Mostowska et al［10］研究發(fā)現(xiàn)AXIN2c.2062C＞T突變?cè)黾恿搜廊笔У娘L(fēng)險(xiǎn)，與本研究結(jié)果一致，由此可以推測(cè)AXIN2c.2062C＞T突變可能是導(dǎo)致先證者（Ⅳ-2）多數(shù)牙缺失的危險(xiǎn)因素之一。AXIN2基因外顯子7上的雜合突變，即第1 807位核苷酸由G變?yōu)镃，屬于錯(cuò)義突變類型，相應(yīng)的第603位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼帷A基的替代發(fā)生在編碼區(qū)，有可能引起相應(yīng)蛋白的變化，從而引起牙發(fā)育的異常。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，堿基異常改變后所對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)相較于正常蛋白結(jié)構(gòu)存在差異。AXIN2基因外顯子7是目前該基因突變的研究熱點(diǎn)之一［1］，但有關(guān)AXIN2G1807C突變位點(diǎn)的報(bào)道較少。在本研究中，表型正常者Ⅲ-2也檢出這一基因突變。因此，先證者（Ⅳ-2）多數(shù)牙先天缺失是否與AXIN2基因的這一突變位點(diǎn)有關(guān)，還是與其他基因共同起作用有關(guān)，有待于深入研究。本研究通過(guò)進(jìn)一步的病例－對(duì)照研究證實(shí)該突變位點(diǎn)與非綜合征型多數(shù)牙先天缺失之間不存在明顯的相關(guān)關(guān)系，為研究AXIN2基因突變與此類疾病之間的關(guān)系提供了一個(gè)新的依據(jù)。

目前，非綜合征型先天缺牙的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該疾病是遺傳和環(huán)境共同作用的一種多因素疾病，具有其復(fù)雜性［11］。迄今為止，對(duì)于引起同一基因型而表型不同的原因尚不明確，基因型和表型之間是否確實(shí)存在劑量關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議。本研究結(jié)果顯示AXIN2c.2062C＞T突變可能是導(dǎo)致先證者（Ⅳ-2）多數(shù)牙缺失的危險(xiǎn)因素之一，證實(shí)AXIN2c.1807G＞C與非綜合征型多數(shù)牙先天缺失之間不存在明顯的相關(guān)關(guān)系。由于多個(gè)基因突變可引起先天缺牙，每個(gè)基因具有多種突變形式，且存在遺傳異質(zhì)性，采用候選基因篩選突變所得的陽(yáng)性率并不高，因而需要收集更多的先天性缺牙家系對(duì)該病的病因?qū)W進(jìn)行探索以及提供足夠的樣本量和參照已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

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Gene mutations in a Chinese family associated with oligodontia：A case-control study

Wang Jing1，2，Chen Jing2，3，Shen Yun1，et al
（1Dept of Stomatology，Shanghai Tenth People＇s Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200072；
2State Key Laboratory of Oral Diseases，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041；

3Laboratory of Oral Biomedical Science and Translational Medicine，Dept of Orthodontics，School of Stomatology，Tongji University，Shanghai 200072

ObjectiveTo investigate the mutation characteristics of paired box homeotic gene 9（PAX9），muscle segment homeobox gene 1（MSX1）and Axis inhibition protein 2（AXIN2）of patients with congenital oligodontia so as to understand the etiology and mechanism.MethodsThe proband and his family members from an ethnic Han family underwent complete physical and oral examinations（including panoramic radiograph）and received retrospective review.Blood samples were collected and polymerase chain reaction（PCR）was taken.Mutation analysis was employed in exon1，2，3，4 of PAX9，exon1，2 of MSX1 and exon 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11 of AXIN2 coding regions.A case-control study on 50 subjects with sporadic tooth agenesis（cases）and 100 healthy controls was performed，which genotyped a novel AXIN2 gene polymorphism（G1807C）.ResultsThe patrilineal grandmother and the maternal grandfather of the proband were found siblings.The proband lacked all teeth except an impacted tooth in the left angulus mandibulae.Other family members maintained normal dentitions.No abnormalities were revealed by clinical examination of the family members，including orofacial cleft，ectodermal abnormalities of hair，skin and sweat glands.Three known AXIN2 gene variants，c.1365A＞G（rs9915936），c.1807G＞C（rs145353986）and c.2062C＞T（p.Leu688Leu）were identified in the proband and some of the family members. No mutation was found in PAX9 and MSX1.No significant difference was found in the allele and genotype frequencies of the novel variant between the subjects and controls.Conclusion Our findings may imply that the AXIN2 c.2062C＞T is a risk factor for congenital oligodontia in the Chinese population and there is no significant association between c.1807G＞C and congenital oligodontia.

non-syndromic congenital missing teeth；paired box homeotic gene 9；muscle segment homeobox gene 1；axis inhibition protein 2

R 780.2

1000－1492（2015）01－0070－05

2014－09－18接收

上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目（編號(hào)：20124Y049）

1同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院口腔科，上海 2000722口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 6100413口腔生物醫(yī)學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，上海 200072

王 璟，女，主治醫(yī)師；賴文莉，女，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wenlilai＠scu.edu.cn