黃曉紅 , 郇 聘 劉保忠

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

貝殼是大多數(shù)軟體動(dòng)物最顯著的特征, 為動(dòng)物生存提供基本保護(hù)。鑒于其重要性, 貝殼發(fā)生機(jī)制的研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。顯微觀察表明, 貝殼發(fā)生起始于胚胎發(fā)育的早期。早在原腸作用剛剛開(kāi)始時(shí), 胚胎的背部細(xì)胞就開(kāi)始變形、內(nèi)陷, 進(jìn)而分泌貝殼物質(zhì), 并在擔(dān)輪幼蟲(chóng)時(shí)期形成最早的貝殼。隨后貝殼逐漸擴(kuò)大并鈣化, 至 D形幼蟲(chóng)時(shí)期, 貝殼首次覆蓋完整幼蟲(chóng)身體, 完成第一階段的發(fā)育[1], 此時(shí)期的貝殼稱作Ⅰ期胚殼(prodissoconch I)。

貝殼的發(fā)生過(guò)程依賴多個(gè)基因的協(xié)同作用。目前該方面是一個(gè)研究熱點(diǎn), 受到重點(diǎn)研究的基因包括dpp,engrailed,hox-1等[2-4]。其中engrailed基因?qū)儆谕串愋位蚣易宄蓡T[5], 具備該家族蛋白典型的同源異形結(jié)構(gòu)域(homeodomain)。與同家族的HOX蛋白一樣, Engrailed通過(guò)其同源異形結(jié)構(gòu)域結(jié)合特定DNA序列, 作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。此外, Engrailed還與多種其他蛋白相互作用(如Pbx蛋白), 并可發(fā)生翻譯后修飾調(diào)節(jié), 從而增加基因表達(dá)調(diào)控的多樣性水平[6-7]。作為典型的發(fā)育相關(guān)基因,engrailed被報(bào)道廣泛參與節(jié)肢動(dòng)物[8-11]、棘皮動(dòng)物[12]、脊索動(dòng)物[10,13]等的分節(jié)、附肢發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程。目前, 多個(gè)軟體動(dòng)物的engrailed基因已被報(bào)道參與貝殼發(fā)生[3,14-16]。軟體動(dòng)物engrailed表達(dá)于正在發(fā)生的貝殼外緣, 可能調(diào)控了貝殼發(fā)生的邊界[3, 14-16]。

長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的經(jīng)濟(jì)貝類, 具備廣泛的研究基礎(chǔ)。同時(shí),其全基因組數(shù)據(jù)在2012年發(fā)布, 使其成為軟體動(dòng)物的一種潛在模式生物。目前長(zhǎng)牡蠣貝殼發(fā)生相關(guān)基因尚未展開(kāi)系統(tǒng)研究。本研究基于長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 鑒定了兩個(gè)engrailed同源基因序列, 分析了其系統(tǒng)演化關(guān)系, 并對(duì)其在貝殼形成關(guān)鍵時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究和比較, 研究結(jié)果將有助于加深作者對(duì)貝殼形成過(guò)程分子調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 幼蟲(chóng)培養(yǎng)及樣品固定

性成熟的長(zhǎng)牡蠣購(gòu)自山東省青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)。選取性腺飽滿的個(gè)體, 解剖獲取配子, 進(jìn)行人工授精。受精卵在 25~26 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng), 持續(xù)充氣, 在受精后14h收集長(zhǎng)牡蠣早期D形幼蟲(chóng), 經(jīng)4%多聚甲醛固定后梯度甲醇脫水, 保存于–20℃中備用。

1.2 engrailed同源基因的克隆

利用已報(bào)道的刺牡蠣Saccostrea kegaki的engrailed基因(GenBank No.BAG68617.1)序列比對(duì)長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(Blastp), 搜索得到兩條engrailed同源基因序列(OYG_10012208及OYG_10012209)。這兩個(gè)參考序列已包括基因的全長(zhǎng) ORF部分, 作者設(shè)計(jì)了全長(zhǎng)ORF引物cgeng1_F (ATGGATGTTAAACAAAAT AACGCGGAGG)、cgeng1_R (TTATGACTCGCCTTCATC CGAAACTGT)和cgeng2_F (ATGTCGGACGTGAA AGT)、cgeng2_R(TCATTGCT CCATCCCATC)。以上述引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證, 成功獲得兩條長(zhǎng)牡蠣engrailed同源基因的全長(zhǎng)cDNA序列, 并分別命名為cgi-eng1和cgi-eng2。為了保證擴(kuò)增反應(yīng)的特異性, 本研究中所用到的所有 PCR擴(kuò)增反應(yīng)均使用了Touchdown PCR, 具體程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性4 min;之后為 18個(gè)逐步降低退火溫度的循環(huán): 95 ℃變性15 s, 68 ℃退火15 s(之后每個(gè)循環(huán)降低1 ℃), 72 ℃延伸1 min; 然后是25個(gè)常規(guī)PCR循環(huán): 95 ℃變性15 s, 50 ℃退火15 s, 72 ℃延伸1 min; 最后72 ℃延伸10 min。

1.3 engrailed同源基因序列特征和聚類分析

利用生物信息學(xué)工具, 對(duì)cgi-eng1和cgi-eng2序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行特征分析, 包括通過(guò)ExPASy網(wǎng)站的在線工具(http://web.expasy.org/computepi/)分析分子量及等電點(diǎn); SignalP網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)的工具預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列; 利用 SMART在線工具(http://smart.emblheidelberg.de/)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì) Cgi-Eng1和Cgi-Eng2中的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)對(duì)不同物種結(jié)構(gòu)域之間的保守性進(jìn)行比較, 并利用 Neighbor-Joining方法進(jìn)行聚類分析。

1.4 整裝原位雜交

分別利用基因特異性引物 cgeng1_wF (CGGA GGCTGCACACGAAC)、cgeng1_wR(GGCGA AGTG GCTACTGGACTAC)和 cgeng2_F、cgeng2_R, 通過(guò)touchdown PCR擴(kuò)增其cDNA序列。將PCR產(chǎn)物連接入 pGEM-T載體(Promega), 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中增殖, 提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒酶切線性化之后作為模板, 使用DIG RNA Labeling Mixture試劑盒(Roche)合成地高辛標(biāo)記的 RNA探針。整裝原位雜交流程按照Maures & Duan報(bào)道的方法進(jìn)行[17], 用Nikon 80i顯微鏡觀察, 拍照。以正義RNA探針作為陰性對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)牡蠣engrailed同源基因及序列特征

長(zhǎng)牡蠣cgi-eng1基因(GenBank No.EKC23208.1)的ORF全長(zhǎng)690bp, 編碼一個(gè)長(zhǎng)229個(gè)氨基酸多肽(圖1), 其理論分子質(zhì)量為 25.7ku, 等電點(diǎn)為 9.62。長(zhǎng)牡蠣cgi-eng2基因(GenBank No.EKC23209.1)的ORF全長(zhǎng) 642bp, 編碼一個(gè)長(zhǎng) 213個(gè)氨基酸的多肽(圖1), 其理論分子質(zhì)量為 24.3ku, 等電點(diǎn)為 9.43。經(jīng)過(guò)SignalP預(yù)測(cè), Cgi-Eng1和Cgi-Eng2均沒(méi)有信號(hào)肽序列。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明二者均具備典型的同源異形結(jié)構(gòu)域, 在Cgi-Eng1中位于第141和203個(gè)氨基酸之間, 在Cgi-Eng2中位于第126和188個(gè)氨基酸之間。根據(jù)相關(guān)的報(bào)道[18-20], 在 Cgi-Eng1和Cgi-Eng2中鑒定到Engrailed蛋白全部的5個(gè)典型結(jié)構(gòu)域(EH1-5)(圖2), 其中EH4即同源異形結(jié)構(gòu)域。多序列比較分析發(fā)現(xiàn), EH2在物種間的保守性最高,EH4次之, 而其他結(jié)構(gòu)域較低(圖2)。

2.2 聚類分析

作者對(duì)來(lái)自包括脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物的engrailed同源基因進(jìn)行了演化分析。結(jié)果如圖3所示, 3個(gè)類群的基因各自聚為一支, 與其演化關(guān)系有很好的對(duì)應(yīng)。在軟體動(dòng)物分支內(nèi)部, 雙殼類和腹足類也各自聚為一支。在雙殼貝類的3種engrailed同源基因間,cgi-eng1先與刺牡蠣S.kegaki的engrailed基因聚成一支, 之后和cgi-eng2聚在一起。這提示cgi-eng1和刺牡蠣已報(bào)到的engrailed基因可能是直系同源基因。

2.3 原位雜交

作者在貝殼發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期——早期 D形幼蟲(chóng)中, 利用整裝原位雜交技術(shù)研究了這兩個(gè)engrailed同源基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,cgi-eng1和cgi-eng2基因mRNA均在長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng)貝殼外緣高表達(dá)(圖4)。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn),cgi-eng1和cgi-eng2的表達(dá)模式存在一定差異:cgi-eng1特異性表達(dá)于貝殼外緣, 在其他部位檢測(cè)不到表達(dá); 而cgi-eng2雖然在貝殼外緣高表達(dá), 但在其他部位亦有廣泛的表達(dá)。作者在陰性對(duì)照組(使用正義鏈探針)沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào), 證實(shí)了雜交結(jié)果的特異性。

圖1 長(zhǎng)牡蠣cgi-eng1和cgi-eng2 cDNA序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of cgi-eng1 and cgi-eng2

圖2 長(zhǎng)牡蠣engrailed同源基因EH1-5結(jié)構(gòu)域的多物種比較分析Fig.2 Multiple alignment of the five conserved domains of cgi-eng1 and cgi-eng2

3 討論

作者從長(zhǎng)牡蠣幼蟲(chóng) cDNA中克隆到兩個(gè)engrailed同源基因cgi-eng1和cgi-eng2。其氨基酸序列預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, Cgi-Eng1和Cgi-Eng2的結(jié)構(gòu)高度保守, 包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中EH4是同源異形結(jié)構(gòu)域, 參與蛋白的相互作用。研究結(jié)果表明 Engrailed能與12種可溶性的核蛋白相互作用[21]。EH2和EH3能與Exd/Pbx蛋白相結(jié)合, 增加engrailed與DNA的結(jié)合能力; 而EH1和EH5參與轉(zhuǎn)錄抑制的激活[22]。多序列比對(duì)表明EH2保守性最高, 這與笠螺Patella vulgata的分析結(jié)果一致[3]。

由于其功能的重要性,engrailed基因一直發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。已有研究結(jié)果表明,engrailed基因是一個(gè)古老的后生動(dòng)物發(fā)育相關(guān)基因, 在演化過(guò)程中發(fā)生了多次獨(dú)立的復(fù)制、基因座的丟失及基因功能的分化等事件, 導(dǎo)致出現(xiàn)了大量的旁系同源基因[22]。目前, 在許多物種中都發(fā)現(xiàn)了多個(gè)engrailed基因。而現(xiàn)有軟體動(dòng)物中的研究均只報(bào)道了一個(gè)engrailed同源基因[2,3]。作者推測(cè), 軟體動(dòng)物可能并非只存在一個(gè)engrailed同源基因, 而是由于基因組信息缺乏的原因?qū)е虏糠殖蓡T尚未鑒定。在本研究中, 作者系統(tǒng)搜索了長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 得到兩條engrailed同源基因序列, 這驗(yàn)證了作者的猜測(cè)。此外, 在聚類分析中, 雙殼貝類的engrailed同源基因并不與已報(bào)道的腹足類基因單獨(dú)聚在一起, 提示engrailed基因在腹足類和雙殼類可能經(jīng)歷了單獨(dú)的演化過(guò)程, 這將是今后研究的一個(gè)重要問(wèn)題。

圖3 長(zhǎng)牡蠣engrailed同源基因氨基序列的聚類分析Fig.3 A phylogenetic tree of cgi-eng1 and cgi-eng2 constructed through the Neighbor-Joining method

圖4 長(zhǎng)牡蠣cgi-eng1和cgi-eng2基因mRNA在長(zhǎng)牡蠣早期D形幼蟲(chóng)的分布情況Fig.4 Expression patterns of cgi-eng1 and cgi-eng2 in early D-veligers (14 hpf)

基于軟體動(dòng)物engrailed基因參與貝殼發(fā)生過(guò)程的報(bào)道[3,14-16], 作者著重觀察了長(zhǎng)牡蠣兩種engrailed同源基因與貝殼發(fā)生的相關(guān)性。作者選擇的早期D形幼蟲(chóng)處于貝殼形成的關(guān)鍵時(shí)期, 此時(shí)貝殼由背部的一個(gè)小區(qū)域逐漸長(zhǎng)大并最終覆蓋整個(gè)幼蟲(chóng)。Nederbragt等[3]首次報(bào)道了engrailed在P.vulgata中表達(dá)于貝殼外緣, 并提出假說(shuō)認(rèn)為engrailed限定了貝殼發(fā)生的邊界; Kin等[2]在S.kegaki的早期D形幼蟲(chóng)的研究結(jié)果也表明engrailed分布于貝殼外緣, 與腹足類的結(jié)果一致。作者在長(zhǎng)牡蠣中的研究表明, 兩種engrailed同源基因均在貝殼外緣高表達(dá), 與前人結(jié)果一致, 支持了engrailed可能參與貝殼發(fā)生的觀點(diǎn)。

除發(fā)現(xiàn)兩種engrailed同源基因均高表達(dá)于貝殼外緣外, 作者還發(fā)現(xiàn)兩種基因的表達(dá)模式存在差別。與cgi-eng1的特異性表達(dá)相比,cgi-eng2雖然也分布與貝殼外緣, 但在幼蟲(chóng)其他部位亦有廣泛的表達(dá),提示其不僅僅參與貝殼邊界的形成過(guò)程, 還可能發(fā)揮其他功能。這些功能是否局限于貝殼發(fā)生過(guò)程, 抑或還參于其他早期發(fā)育事件, 需要進(jìn)一步的研究以加以佐證。

本研究基于長(zhǎng)牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 首次鑒定了長(zhǎng)牡蠣的兩種engrailed同源基因, 展示了其與貝殼發(fā)生的相關(guān)性, 并提出二者可能存在功能差異。在下一步的工作中, 深入解析engrailed同源基因在貝殼發(fā)生中的具體功能, 及不同engrailed同源基因的功能差異將是研究的重點(diǎn)內(nèi)容。此外, 本文中作者僅考察了一個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期的engrailed基因表達(dá)情況,而并未對(duì)engrailed在發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化情況展開(kāi)研究。在后續(xù)的工作中將有必要系統(tǒng)研究整個(gè)早期貝殼發(fā)育階段engrailed基因的表達(dá)情況, 比如從擔(dān)輪幼蟲(chóng)(25~26 ℃時(shí)約11 hpf)到完全發(fā)育的D形幼蟲(chóng)(約24 hpf)。這些研究一方面可以驗(yàn)證作者的結(jié)論,另一方面還可能發(fā)現(xiàn)新的功能提示信息。

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