周孫林, 陳華新, 姜 鵬, 李富超, 唐東山,

(1.南華大學 污染控制與資源化湖南省高校重點實驗室, 湖南 衡陽 421000; 2.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071; 3.南華大學 環(huán)境保護與安全工程學院, 湖南 衡陽 421001)

藻膽蛋白是藍藻、紅藻、隱藻和某些甲藻中特有的重要捕光色素蛋白, 由藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合而成, 具有增強人體免疫力、抗氧化和抗腫瘤作用, 并可用作食品天然色素。藻膽蛋白具有熒光特性, 在免疫組化、熒光免疫分析等領域有著廣闊的應用前景。別藻藍蛋白是藻膽蛋白中的一種, 目前大多提取自各種藻類, 但天然別藻藍蛋白的制備需要經過藻種選育、培養(yǎng)、回收與純化等過程, 時間及經濟成本大, 且得到的蛋白穩(wěn)定性不高, 因此市面價格極高, 很大程度上限制了它的廣泛應用。

利用代謝工程的方法實現別藻藍蛋白在大腸桿菌體內的生物合成[1], 為藻膽蛋白的制備提供了一種新的途徑[1-4]。本實驗室將嗜熱藍藻(Synechococcus elongatusBP-1)的別藻藍蛋白 α亞基基因插入載體pCDFDuet-1第一表達框內, 同時將催化合成藻藍膽素的亞鐵血紅素氧化酶基因Ho1和膽綠素還原酶基因PcyA插入載體pCDFDuet-1第二表達框內, 得到質粒 pCDF-apcA-Ho1-PcyA; 并將催化色基與 apcA共價結合的裂合酶基因CpcS和CpcU插入載體pRSFDuet-1第二表達框內, 得到質粒 pRSF-cpcS-cpcU。將上述質粒共轉化大腸桿菌, 利用大腸桿菌本身具有亞鐵血紅素這一特性, 實現了重組別藻藍蛋白α亞基的體內重組[2]。與天然別藻藍蛋白相比, 它具有結構單一, 理化性質穩(wěn)定等優(yōu)點。大腸桿菌中生物合成別藻藍蛋白受多種因素影響, 張偉杰等[5]對重組別藻藍蛋白誘導條件進行了優(yōu)化, 但上述試驗中利用的優(yōu)化方法均為單因素試驗, 即單次單因子法(One-factor-at-a-time design), 這種方法是在假設因素間不存在交互作用的前提下, 一次改變一個因素的水平而其他因素保持不變, 對每個因素逐一考察。這種方法的優(yōu)點是簡單、結果明了, 不需要專門的統計學知識, 因此一直都是條件優(yōu)化的常用方法。但是由于作者通?？疾斓膶嶒炓蛩亻g存在一定的交互作用, 該方法得出的結果無法全面的說明各因素與響應值之間的復雜關系, 且當考察的因素較多時,需要試驗次數多和試驗周期長, 因此單因素法在條件優(yōu)化過程中常常用于初步的篩選試驗[6-9]。

本試驗利用響應面中心組合設計試驗方法對誘導條件進行了進一步優(yōu)化, 響應面設計法(Responsesurface methodology, RSM)是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法, 是數學方法和統計方法結合的產物, 它可以用來對受多個變量影響的響應問題進行建模與分析, 并可以將該響應進行優(yōu)化。該法不但具備試驗次數少, 周期短、精度高等優(yōu)點, 而且可以建立連續(xù)變量曲面模型, 同時對影響試驗指標的各因子水平及其交互作用進行優(yōu)化和評價, 可快速有效的確定多因子系統的最佳條件[6,9-10]。

試驗利用中心組合設計對重組別藻藍蛋白 α亞基表達體在大腸桿菌中誘導表達的影響因素進行了影響顯著性及各因素間交互性考察, 通過驗證試驗比較, 證實了優(yōu)化條件下誘導得到的同體積表達量是未優(yōu)化條件的2.3倍, 驗證試驗結果與優(yōu)化試驗預測值相符。該誘導結果與以往文獻[12]報道結果相比提高了70 %~580 %, 且IPTG使用濃度經優(yōu)化后減少至原使用濃度的十分之一, 為文獻[12]報道使用濃度(IPTG 0.5 mM)的五分之一, 降低了發(fā)酵成本。試驗證明響應面法-中心組合設計對重組別藻藍蛋白α亞基的誘導條件優(yōu)化確實可行。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

菌株: 基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pCDF-apcA-Ho1-pcyA/pRSF-cpcU-cpcS 由中國科學院海洋研究所構建, 含有別藻藍蛋白 α亞基生物合成相關的5個基因。

活化菌種所用培養(yǎng)基: LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L, NaCl 10 g/L; pH值7.4)

誘導所用培養(yǎng)基: TB培養(yǎng)基(蛋白胨12 g/L, 酵母粉12 g/L, 磷酸鹽緩沖液(72 mmol/L K2HPO4; 17 mmol/L KH2PO4), 甘油 4 ‰)

試劑: 酵母粉和蛋白胨購自Oxoid公司, 卡那霉素, 壯觀霉素和IPTG購自Solarbio公司, 其他試劑購自國藥化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 響應面(RSM)因素水平

根據以往文獻報道試驗結果[5]確定 4因素(誘導溫度、誘導時機、培養(yǎng)基初始pH、誘導劑IPTG終濃度)用于中心組合試驗設計作4因素5水平實驗設計, 共30組實驗, 其中中心點6組(用于評估隨機誤差對實驗結果造成的影響), 每組重復 3次平行試驗(共計90組實驗)。實驗設計因素水平見表1。

表1 中心組合設計試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of central composition design

1.2.2 菌種的誘導表達

取保存的同等活力菌種按 0.5 %的接種量接種于加壯觀霉素 (100 μg/mL)和卡那霉素 (50 μg/mL)抗性的50 mL LB培養(yǎng)基中, 37 ℃ , 200 r /min回旋式搖床中培養(yǎng) 15 h。按 4%的接種量, 接種至不同 pH值的25 mL TB培養(yǎng)基中, 37 ℃劇烈振搖(200 r/min)不同時長, 再于超凈臺加入IPTG至不同終濃度, 在試驗設計的各自溫度下誘導相同時長(8 h)。

1.2.3 熒光強度的測定

使用熒光分光光度計 F-4500 (Hitachi, Japan)直接對誘導得到的菌液進行熒光值測定, 后對其進行數據處理。所設參數為掃描范圍600~700 nm, 在590 nm激發(fā)光波長下掃描其熒光發(fā)射光譜, 掃描速度240 nm/s,熒光最大值設為1000, 熒光值超過1000的樣品對菌體稀釋相應倍數后測定, 記錄其熒光發(fā)射峰值及其峰值處的波長。

1.2.4 響應面(CCD)分析法

預試驗中, 菌液熒光值 0~500 a.u.范圍內, 菌液熒光值與蛋白表達量呈線性關系, 即菌液經離心破碎后得到重組熒光蛋白的表達量(mg/L)=(1.8×菌液熒光值-1.9513)/22.781。試驗中以菌液熒光值為響應值, 反應了不同因素對重組別藻藍蛋白表達量的影響。利用Design-Expert 8.0軟件建立多元二次回歸方程, 對方程進行模型回歸和方差分析, 確定別藻藍蛋白(holo-apcA)誘導表達的最佳條件, 分別以優(yōu)化條件和以往誘導條件進行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 中心組合設計試驗優(yōu)化重組別藻藍蛋白(holo-apcA)的發(fā)酵條件

2.1.1 響應面法中心組合設計及試驗結果

根據響應面法中心組合設計試驗設計原理作四因素 5水平試驗設計。中心組合設計及試驗結果見下表3。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2中數據進行多元回歸擬合, 得到4因素A(誘導溫度)、B(發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH)、C(IPTG 終濃度)、D(誘導時機)與響應值R之間的回歸方程為:

表2 中心組合試驗設計及結果Tab.2 Coded and real values of variables in central composition design

表3 響應面二次模型回歸方程的方差分析結果Tab.3 Analysis of variances for full quadratic model

R=95.16+16.1A+15.08B-6.08C+31.40D+5.79AB-

2.1.2 回歸模型方差分析

利用Design expert 8.0軟件對響應面二次模型回歸方程進行方差分析, 結果見表3和表4。

從表3可以看出, 該模型的F值為9.37,Prob>F值為<0.0001, 說明該模型極顯著, 僅有不到 0.01%的概率不能用該模型來解釋; 失擬項Prob>F=0.1637>0.05, 失擬不顯著, 說明回歸方程的擬合度較好; CV%= 29.84, 較低, 說明試驗操作可信; 預測R2值為0.8974, 校正后RAdj2= 0.8016, 說明該模型可以解釋89.74%的試驗所得的響應值的變化。從表4可以看出, 影響因子A(誘導溫度)、B(pH)、D(誘導時機)的P值均小于0.05, 說明這3個因素對模型影響顯著, 其中D的P值<0.0001, 影響極顯著; 而C(IPTG終濃度)的P值=0.1766>0.05, 對模型的影響不顯著, 各因素對響應值的影響順序為:D>A>B>C;且各因素間存在交互作用, 交互項AD的P值小于0.05, 影響顯著; 另外二次項A2、D2的P值也小于0.05, 影響顯著, 其中A2的P值<0.0001影響極顯著,其余項不顯著。交互項及二次項的顯著性進一步說明各影響因子對響應值的影響不是簡單的線性關系,不能單靠單因素試驗來進行優(yōu)化。

表4 各編碼因素水平方差分析Tab.4 Analysis of variances for holo-apcA production in coded level variables

2.1.3 響應曲面分析

響應曲面是在所考察的四因素中的任意兩因素水平固定的前提下, 以中心組合設計中的響應值為縱坐標, 其他兩個因素分別為水平面上的兩垂直橫坐標所構成的三維模型。模型中每個響應面分別代表2個獨立變量之間的相互作用, 兩因素相互之間交互作用對響應值的影響顯著的模型曲面呈馬鞍型,等高線呈橢圓形; 反之, 則模型曲面呈圓滑型, 等高線呈圓形。二次回歸方程的響應面及等高線圖見圖1, 圖中由各響應曲面及相應的等高線可以看出, (a)圖誘導溫度與培養(yǎng)基初始pH之間以及(d)圖IPTG終濃度與培養(yǎng)基初始pH之間的交互作用均不顯著, 表現為響應曲面圓滑, 變化平緩, 等高線呈圓形; 而其余圖(b, c, e, f)的兩因素間交互作用都比較明顯, 表現為曲面呈馬鞍型, 在靠近極值處響應值驟變, 等高線呈橢圓形。

2.2 驗證試驗

根據得到的擬合方程, 可采用繪制出響應面圖的方法獲得最優(yōu)值, 也可采用方程求解的方法獲得最優(yōu)值。本試驗中直接通過Design-Expert軟件在響應曲面圖中得出重組別藻藍蛋白發(fā)酵的最佳條件為:誘導溫度28 ℃, 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.5, 加入IPTG的終濃度0.1 mmol/L, 誘導時機為菌體轉接后3 h。在此條件下軟件得出的回歸模型預測值為菌液熒光值269.5, 即蛋白表達量為21.2 mg/L。

為驗證模型預測的準確性及優(yōu)化方案的可行性,根據軟件得出的優(yōu)化方案進行了驗證試驗, 試驗重復3次, 取平均值。實測誘導得到的菌液熒光值258.7 au,即重組別藻藍蛋白表達量為20.4 mg/L, 與軟件預測值相對誤差為 4 %, 說明響應面優(yōu)化得到的模型與試驗數據擬合度較好, 達到了優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件的目的。

3 討論

藻膽蛋白作為藻類特有的重要捕光色素蛋白,在臨床醫(yī)學診斷和免疫組化等研究領域有著廣闊的應用前景, 因此, 近年來對于藻膽蛋白制備與應用等相關研究較多。其中關于重組別藻膽蛋白在大腸桿菌體內誘導表達的試驗研究中, 包括了一部分對其誘導表達條件的探索及優(yōu)化試驗[5,11], 文獻報道的對重組別藻藍蛋白誘導表達條件的優(yōu)化方法一般采用單因素試驗, 該試驗方法忽略了試驗中因素間的交互作用, 得到的優(yōu)化條件不一定為最優(yōu)。因此,本試驗利用響應面-中心組合設計試驗對重組別藻藍蛋白誘導表達條件進行了進一步的優(yōu)化。

通過 Design-expert 8.0軟件得出了各因素優(yōu)化值和優(yōu)化條件下的響應值。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為: 誘導溫度28℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 8.5、誘導時機3 h、IPTG終濃度0.1 mmol/L, 在此條件下發(fā)酵得到的重組別藻藍蛋白(holo-apcA)表達量為20.4 mg/L, 與軟件預測值相對誤差為 4 %, 說明響應面優(yōu)化得到的模型與試驗數據擬合度較好, 達到了優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件的目的, 與優(yōu)化前本試驗原始誘導條件誘導的結果(即表達量 9 mg/L)相比較, 蛋白表達量增加為原來的2.3倍, 與文獻報道的重組別藻藍蛋白α亞基蛋白表達量3~12 mg/L[12]相比較, 表達量提高了70 %~580 %。該發(fā)酵條件與原發(fā)酵條件相比主要不同在于發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH由原來的7.4增大到現在的8.5, IPTG使用終濃度由原來的1 mmol/L減少到現在的0.1 mmol/L。

圖1 各因素交互作用及其對別藻藍蛋白表達量影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface curves and contour plot of factor interaction effecting on holo-apcA production

表5 最優(yōu)化發(fā)酵條件驗證試驗結果Table.5 Validation of the model

發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH對菌體的生長和產物的表達均存在一定的影響, 因為乙酸是大腸桿菌的主要副產物, 它對細菌生長和產物的表達都有抑制作用[13-15], 劉永軍等[16]通過試驗得到大腸桿菌的最適生長酸度為7.82, 較高的初始pH對菌體生長過程中產生的乙酸存在一定的調節(jié)作用, 促進菌體的生長與產物的表達。培養(yǎng)基的pH還將影響酶分子和底物分子的帶電狀況, 從而影響酶的合成, 使代謝和細胞透性發(fā)生變化[17]。分析pH的增加可能導致細胞膜通透性的增大, 從而有利于誘導劑IPTG進入到細胞內部與阻遏蛋白結合, 起到誘導效果。由于IPTG是一種作用極強的誘導劑, 不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此少量的 IPTG在較高通透性的細胞間可自由出入, 對多個細胞起到誘導作用。而由響應面圖1可以看出, IPTG終濃度過高反而會導致表達量的減少,由于 IPTG對工程菌的生長有著明顯的抑制作用[18-19],菌體量不足固然導致蛋白表達量的降低。

通過響應面模型分析得出影響因素A(誘導溫度)與D(誘導時機)間存在明顯的交互作用。交互作用是兩種或兩種以上因子的綜合效果[20], 在統計學上的定義為: 如果因素A的數值和水平發(fā)生變化, 試驗指標隨因素B變化的規(guī)律發(fā)生變化; 或反之, 若因素B的數值或水平發(fā)生變化時, 試驗指標隨因素A變化的規(guī)律也發(fā)生變化。AD(即誘導溫度和時機)的交互作用表現為:AD(即誘導溫度和時機)的交互作用表現為: 誘導時機隨著誘導溫度的上升而縮短,反之, 隨著誘導溫度的降低, 誘導時機則相應延長。大腸桿菌生長最適溫度為37 ℃, 試驗得到蛋白表達的最適誘導溫度為 28 ℃, 最適誘導時機為 3 h, 由于誘導的最佳時機為菌體生長的對數期, 該階段菌體生長活性高, 菌體內蛋白表達效率也高。若一定時長范圍(本試驗 1 ~3 h)內菌體誘導時機(即誘導前培養(yǎng)時長)較長, 誘導前菌體生長則較接近對數期, 進入誘導階段后誘導溫度越高則菌體生長越快, 較高的誘導溫度使得菌體在原對數期的基礎上繼續(xù)快速繁殖, 菌液中由于菌體量的迅速增多使得營養(yǎng)物質缺乏和代謝物堆積, 從而使菌體生長很快進入穩(wěn)定期, 菌體活性降低, 蛋白表達量從而受到影響; 且由于大腸桿菌體內自身會合成一些蛋白酶, 酶在一定范圍內溫度越高其活性越高, 發(fā)酵得到的蛋白在較高溫度下可能被蛋白酶部分降解, 從而降低了最終獲取蛋白量。若一定時長范圍(本試驗1 ~3 h)內菌體誘導時機(即誘導前培養(yǎng)時長)較短, 誘導前菌體生長尚未達到對數期, 進入誘導階段后誘導溫度越高則菌體生長越快, 菌體在較適宜溫度下生長達到對數期, 在對數期維持一定時長后再進入穩(wěn)定期, 菌體在蛋白誘導表達過程中大部分時間停留在整個對數期內, 菌體活性高, 蛋白表達量高。

綜上所述, 利用響應面優(yōu)化法優(yōu)化重組別藻藍蛋白發(fā)酵條件不但提高了蛋白的表達量, 還減少了IPTG的用量, 降低了發(fā)酵成本。該試驗結果為重組大腸桿菌大規(guī)模發(fā)酵制備別藻藍蛋白提供了依據。

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