侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

低能激光照射對(duì)梗死后心肌微環(huán)境影響的實(shí)驗(yàn)研究*

侯劍峰，袁昕，張浩，鄭哲，胡盛壽

目的：探討低能激光照射（LLLI）對(duì)梗死后心肌微環(huán)境的影響。

方法：冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作SD大鼠心肌梗死模型。3周后，經(jīng)超聲心動(dòng)圖篩選合格心肌梗死大鼠隨機(jī)分為三組：①LLLI 組：心肌梗死后開胸接受LLLI預(yù)處理（n=26）；②對(duì)照組：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射（n=27）;③假手術(shù)組：?jiǎn)渭冮_胸，冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不行結(jié)扎（n=24）。LLLI 預(yù)處理采用635 nm 半導(dǎo)體低能激光（輸出功率：5 mW；照射時(shí)間：150秒；能量密度：0.96 J/cm2）開胸單次照射。LLLI 預(yù)處理后1小時(shí)、1天、1 周，以免疫蛋白印跡法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)法分別檢測(cè)預(yù)LLLI 處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定LLLI 預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，TUNEL法檢測(cè)照射區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)左心功能。

結(jié)果：LLLI顯著提高了梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)及SOD的活性，降低了MDA的含量。但未能顯著改善梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞凋亡和左心功能。

結(jié)論：LLLI能夠通過(guò)降低梗死后心肌組織氧化應(yīng)激水平改善局部微環(huán)境。

低能激光照射；心肌梗死；微環(huán)境

Methods: The myocardial infarction (MⅠ) model was established by left anterior descending (LAD) artery ligation in female rats. 3 weeks later, the qualified MⅠ rats were randomly divided for 3 groups:①LLLⅠpreconditioning group, the rats received thoracotomy for LLLⅠ by a 635nm, 5mW diode laser with the energy density of 0.96 J/cm2for 150 seconds, n=26. ②Control group, the rats received thoracotomy for daylight irradiation, n=27.③Sham operation group, the rats received thoracotomy without LAD ligation, n=24. The Expressions of myocardial vascular endothelial growth factor (VEGF), glucose-regulated protein 78 (GRP78), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were evaluate by real time-PCR, Western blot analysis and other relevant laboratory test at 1 hour, 1 day and 1 week after treatment. The myocardial cell apoptosis was examined by TUNEL staining, and left ventricular function was detected by echocardiography.

Results: LLLⅠ preconditioning obviously increased the myocardial VEGF, GRP78 expression and SOD activity, decreased MDA production; while it could not really improve the myocardial cell apoptosis at periinfarcted area and left ventricular function in experimental rats.

Conclusion: LLLⅠ preconditioning may improve the milieu of infarcted myocardium via decreasing the oxidative stress in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:47.)

低能激光照射（LLLI）療法是使用輸出功率為毫瓦級(jí)的低能量或低強(qiáng)度激光處理靶組織，在不引起組織或細(xì)胞損傷的情況下，對(duì)組織局部或全身起到刺激、調(diào)節(jié)、活化等生物刺激效應(yīng)的激光療法[1]。本研究旨在利用LLLI生物刺激效應(yīng)作為預(yù)處理策略，觀察LLLI對(duì)梗死后心肌組織微環(huán)境的作用并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法：2011-09至2013-10期間進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，均由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重260～280 g，雌雄各半。采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立心肌梗死模型[2]。3周后，使用超聲心動(dòng)圖篩選大鼠心肌梗死模型[左心室短軸縮短率（LVFS）＜30%，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜60%]，將77只存活大鼠隨機(jī)分為三組：①LLLI 組（n=26）：心肌梗死后開胸接受LLLI預(yù)處理；②對(duì)照組（n=27）：心肌梗死后單純開胸，日光燈照射；③假手術(shù)組（n=24）：?jiǎn)渭冮_胸，冠狀動(dòng)脈左前降支只穿線不行結(jié)扎。

低能激光照射療法預(yù)處理方法：InGaAsP半導(dǎo)體低能激光治療儀，調(diào)節(jié)激光輸出模式為連續(xù)輸出模式，激光輸出波長(zhǎng)635 nm，600 μm光導(dǎo)纖維傳輸，光纖末端輸出功率5 mW，照射距離26 mm，光斑直徑10 mm，功率密度6.37 mW/cm2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)定照射時(shí)間為150 s，相對(duì)應(yīng)的能量密度為0.96 J/cm2。自制直徑為10 mm無(wú)菌碘伏紗布在激光照射時(shí)遮蓋除照射區(qū)之外其他組織，避免激光散射引起實(shí)驗(yàn)誤差。

觀察指標(biāo)：LLLI 預(yù)處理后1小時(shí)、1天、1周，以免疫蛋白印跡法（Western blotting）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）法分別檢測(cè)LLLI預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，分別以黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法測(cè)定LLLI預(yù)處理區(qū)內(nèi)心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測(cè)定法（TUNEL法）檢測(cè)照射區(qū)心肌細(xì)胞凋亡，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)左心功能。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；組間差異性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠梗死后心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78表達(dá)及超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的比較

LLLI預(yù)處理對(duì)照射區(qū)域梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)、SOD的酶活及MDA的含量的不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖1所示。在預(yù)處理后1小時(shí)和1天，與對(duì)照組比較，LLLI組梗死后心肌組織中VEGF、GRP78的表達(dá)及SOD活性均顯著提高（P＜0.05）；而MDA含量顯著降低（P＜0.05）。在預(yù)處理后1周，LLLI組與對(duì)照組的上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 低能激光照射預(yù)處理對(duì)梗死后心肌組織的影響

2.2 低能激光照射預(yù)處理對(duì)心肌梗死邊帶區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

LLLI預(yù)處理后1周，組織冰凍切片經(jīng)熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)：發(fā)生凋亡的細(xì)胞經(jīng)TUNEL法檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核呈黃綠色，典型圖片如圖2所示。對(duì)照組和LLLI組的凋亡細(xì)胞百分比分別為（10.3±1.9）%和（10.1±1.8）%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 低能激光照射對(duì)心肌梗死邊帶區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

2.3 左心室功能評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)LLLI對(duì)心功能的改善情況，LLLI后1周對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。LLLI組與對(duì)照組比較，左心室射血分?jǐn)?shù)[（43.26±5.02）% vs（41.86±3.46）%]、左心室短軸縮短率[（17.27±2.44）% vs（16.56±1.67）%]、左心室舒張末期內(nèi)徑[（6.17±0.52） mm vs（6.24±0.50）mm]和左心室收縮末期內(nèi)徑[（7.45±0.52） mm vs（7.49±0.61）mm]，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

LLLI是經(jīng)FDA審批的無(wú)顯著危害級(jí)（NSR）物理治療設(shè)備，由于其安全性高，成本低及操作簡(jiǎn)便，LLLI物理治療已被臨床廣泛接受。既往研究顯示，能量密度為1～4 J/cm2的LLLI治療在多種疾病的治療中顯示出良好的治療效果[3,4]。在本研究中LLLI的參數(shù)設(shè)定如下：輸出功率為5 mW，照射時(shí)間為150 s，功率密度為6.37 mW/cm2，能量密度為0.96 J/cm2。通過(guò)LLLI預(yù)處理梗死后心肌組織，我們主要對(duì)LLLI進(jìn)行了兩方面指標(biāo)的評(píng)價(jià)：以GRP78，VEGF為代表評(píng)價(jià)LLLI提高照射區(qū)細(xì)胞保護(hù)因子分泌；以SOD、MDA的測(cè)定評(píng)價(jià)LLLI提高局部組織抗氧化能力作用。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LLLI在細(xì)胞移植前的預(yù)處理顯著提高了照射局部組織VEGF和GRP78的表達(dá)。而VEGF和GRP78在局部心肌組織內(nèi)的提高已被證實(shí)可以在心肌缺血過(guò)程中發(fā)揮重要的心肌保護(hù)作用[5-7]。在Tuby等[8]的研究顯示，LLLI單次直接照射心肌組織，可以顯著提高急性心肌梗死后心肌組織內(nèi)VEGF和iNOS的表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，限制了心肌梗死面積的擴(kuò)大。

我們的研究也發(fā)現(xiàn)：LLLI在細(xì)胞移植前的預(yù)處理顯著提高梗死后組織中抗氧化物質(zhì)SOD的酶活，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。在Zhu等[9]的研究中發(fā)現(xiàn)，以660 nm波長(zhǎng)的LLLI處理冷保存的大鼠離體心臟，能夠促進(jìn)復(fù)蘇后心臟功能的恢復(fù)，這一作用認(rèn)為與LLLI處理使心肌細(xì)胞內(nèi)ATP的含量及抗氧化酶的活性得以維持有關(guān)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LLLI單次預(yù)處理心肌組織產(chǎn)生顯著微環(huán)境改善效應(yīng)在預(yù)處理后迅速出現(xiàn)，但在1周即消失，而且這種短暫的心肌微環(huán)境改善作用對(duì)梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡以及心功能的改善沒(méi)有顯著影響，這一結(jié)果提示我們，選擇新的組織穿透力較好的LLLI設(shè)備或是改進(jìn)LLLI預(yù)處理的技術(shù)，如設(shè)計(jì)以光導(dǎo)纖維進(jìn)行激光傳輸經(jīng)皮穿刺行LLLI心肌表面預(yù)處理的技術(shù)可能進(jìn)一步提高預(yù)處理效果。

[1] Moshkovska T, Mayberry J. It is time to test low level laser therapy in Great Britain. Postgrad Med J, 2005, 81: 436-441.

[2] 張浩,胡盛壽,鄭哲, 等.高齡和青年大鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞移植對(duì)缺血心臟心功能的影響.中華心血管病雜志, 2004, 32: 359-361.

[3] Manchini MT, Serra AJ, Feliciano Rdos S, et al. Amelioration of cardiac function and activation of anti-inflammatory vasoactive peptides expression in the rat myocardium by low level laser therapy. PLoS One, 2014, 9: e101270.

[4] 郭靜萱, 陳明哲. 心血管病激光治療的現(xiàn)狀與展望. 中國(guó)循環(huán)雜志, 1993, 12: 754-756.

[5] Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptoticfactors by human adipose stromal cells. Circulation, 2004, 109: 1292-1298.

[6] Shintani-Ishida K, Nakajima M, Uemura K, et al. Ischemic preconditioningprotects cardiomyocytes against ischemic injury by inducing GRP78. BiochemBiophys Res Commun, 2006, 345: 1600-1605.

[7] 劉燃, 孫林, 張戈. 人參皂苷Rg1對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2014, 1: 77-79.

[8] Tuby H, Maltz L, Oron U. Modulations of VEGF and iNOS in the rat heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and enhanced angiogenesis. Lasers Surg Med, 2006, 38: 682-688.

[9] Zhu Q, Yu W, Yang X, et al. Photo-irradiationimproved functional preservation of the isolated rat heart. Lasers Surg Med, 1997, 20: 332-339.

Effect of Low-Level Laser Irradiation Preconditioning on Milieu of Infarcted Myocardium in Experimental Rats

HOU Jian-feng, YUAN Xin, ZHANG Hao, ZHENG Zhe, HU Sheng-shou.
Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Ⅰnstitute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China Corresponding Author: HU Sheng-shou, Email: shengshouhu@yahoo.com

Objective: To explore the effect of low-level laser irradiation (LLLⅠ) preconditioning on milieu of infarcted myocardium in experimental rats.

Low-level laser irradiation; Myocardial infarction; Milieu

2014-08-04）

（編輯：許 菁）

北京市科技新星計(jì)劃（Z111107054511080）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃（2013D009008000004）

100037北京市，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國(guó)家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作者簡(jiǎn)介：侯劍峰 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病外科基礎(chǔ)與臨床研究 Email: hjf2006111@163.com 通訊作者：胡盛壽

Email: shengshouhu@yahoo.com

R54

A

1000-3614（2015）01-0047-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.01.013