彭 程，王素春，莊青葉，侯廣宇，黃 娟，單 虎，陳繼明

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

山東省外觀健康羊群中檢出羊邊界病病毒

彭 程1，2，王素春2，莊青葉2，侯廣宇2，黃 娟1，單 虎1，陳繼明2

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

2014年從山東省外觀健康的牛羊采集鼻拭子樣品共707份，提取其RNA，用流感病毒特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。對(duì)RT-PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，意外發(fā)現(xiàn)其中1份羊拭子樣品含有羊邊界病病毒，并且該結(jié)果得到其他試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)合我國(guó)2012年首次在安徽和江蘇兩地檢出該病毒，以及當(dāng)前我國(guó)羊群流通情況，推測(cè)該病毒可能在我國(guó)有所存在。該調(diào)研結(jié)果對(duì)分析各類(lèi)RT-PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性產(chǎn)生原因，有參考意義。并提示RT-PCR檢測(cè)結(jié)果難以作為疫病或感染病診斷的確切依據(jù)。其診斷結(jié)果有時(shí)需要用熒光探針或測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

邊界病病毒；羊；RT-PCR；系統(tǒng)進(jìn)化；假陽(yáng)性；山東

邊界病（border disease，BD）是由黃病毒科瘟病毒屬的邊界病病毒（BDV）引起的以綿羊?yàn)橹鞯穆赃M(jìn)行性傳染病[1]。該病主要侵害羊胎和羔羊，以新生羔羊骨骼肌震顫和被毛異常為主要特征。BDV還可感染山羊、牛、其他反芻動(dòng)物和豬。

目前，許多國(guó)家和地區(qū)已發(fā)現(xiàn)BDV的存在。2012年，我國(guó)首次在安徽和江蘇發(fā)生腹瀉的羊場(chǎng)中檢測(cè)到BDV[2-4]。2014年，我們?cè)谶M(jìn)行牛、羊的流感病毒檢測(cè)時(shí)，意外地從山東省外觀健康羊群中檢出BDV，我們對(duì)此結(jié)果進(jìn)行了深入分析，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

采集來(lái)自山東平度和萊西共15個(gè)牛場(chǎng)和10個(gè)羊場(chǎng)健康牛、羊的鼻腔黏液。根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)模大小，每場(chǎng)隨機(jī)采集樣品20-40份。牛鼻腔拭子樣品450份，羊鼻腔拭子樣品257份，合計(jì)707份。拭子置于含10%甘油和抗生素的PBS保存液中，冷藏下運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.2 RNA提取

將拭子樣品10000 r/min離心10 min，取200μL上清液，用QIAxtractor高通量核酸提取儀及其配套試劑盒cador?Pathogen 96 QIAcube?HT Kit（德國(guó)QIAGEN公司）提取病毒RNA。

1.3 流感病毒RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的丙型流感病毒基因序列作為參考序列，設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)丙型流感病毒的保守性引物（表1）。用該引物和Takara Prime-ScriptTM One Step RT-PCR試劑盒對(duì)所提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)反應(yīng)條件見(jiàn)表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAxcel advanced全自動(dòng)實(shí)時(shí)毛細(xì)管電泳儀（德國(guó)QIAGEN公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4 克隆測(cè)序

陽(yáng)性RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳后，進(jìn)行回收純化，再連接至pMD-19T載體，進(jìn)行克隆測(cè)序。

表1 本研究所用的三個(gè)RT-PCR檢測(cè)方法

圖1 測(cè)出的BDV核酸序列系統(tǒng)分析結(jié)果

1.5 序列同源性和遺傳進(jìn)化分析

測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行比對(duì)。用MEGA 5.0軟件進(jìn)行核苷酸最佳變異模式的計(jì)算，再按照此最佳變異模式，即貝葉斯信息標(biāo)準(zhǔn)值（Bayesian Information Criterion）最小的模式，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.6 BDV進(jìn)一步確認(rèn)

用BDV兩個(gè)特異性RT-PCR反應(yīng)（表1），對(duì)相應(yīng)的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，此復(fù)核RT-PCR陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果也進(jìn)行序列測(cè)定和BLAST比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品RT-PCR檢測(cè)

將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)毛細(xì)管電泳，25個(gè)牛、羊養(yǎng)殖場(chǎng)的共707份樣品中，有22個(gè)樣品在目的條帶（約為619bp）附近出現(xiàn)疑似陽(yáng)性條帶。其中，牛、羊拭子樣品各11個(gè)。

2.2 序列分析

將克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)牛拭子陽(yáng)性樣品RT-PCR擴(kuò)增的序列為流感病毒序列，并且該流感病毒與美國(guó)2013年首次發(fā)現(xiàn)的牛流感病毒高度同源，已另文發(fā)表[5]；而羊拭子陽(yáng)性樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與BDV的序列高度同源。該序列已經(jīng)提交GenBank（收錄號(hào)為：KP091736）。 用 Mega軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，進(jìn)一步確認(rèn)該序列為BDV序列（圖1），說(shuō)明該RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的一份綿羊拭子樣品中含有BDV。

2.3 陽(yáng)性結(jié)果復(fù)核

通過(guò)上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的BDV陽(yáng)性綿羊鼻拭子樣品，用BDV兩個(gè)特異性RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，結(jié)果全為陽(yáng)性（圖2）。對(duì)這兩個(gè)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸序列，經(jīng)

BLAST比對(duì)，全為BDV的序列。這進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)綿羊鼻拭子樣品確實(shí)含有BDV。

圖2 BDV兩個(gè)特異性RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

2012年，我國(guó)首次從安徽和江蘇兩地羊群中檢出BDV[2-4]。本次調(diào)研又意外地首次從我國(guó)山東省檢出BDV。因此，我們推測(cè)BDV可能在我國(guó)有所存在，這與BDV在國(guó)際上分布廣泛[1]，也是一致的。我國(guó)2014年在羊的小反芻獸疫疫情流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)我國(guó)活羊（尤其是羊羔）跨省運(yùn)輸頻繁，可能有助于BDV在我國(guó)跨省傳播。此外，該病毒可引起持續(xù)性感染，并且既可以水平傳播，也可以垂直傳播，這些都有利于該病毒擴(kuò)大其地理分布范圍。

本文用流感病毒的引物對(duì)707份樣品進(jìn)行檢測(cè)，只檢測(cè)到1份BDV陽(yáng)性；但由于該引物與BDV匹配性較差，該結(jié)果并不表明這707份樣品中只有1個(gè)BDV陽(yáng)性。

RT-PCR是動(dòng)物疫病診斷、檢測(cè)、監(jiān)測(cè)常用的方法。同其他方法一樣，該方法也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。以往人們常常僅關(guān)注RT-PCR假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)概率或如何降低這種概率，未曾深入分析為何出現(xiàn)假陽(yáng)性。我們這次調(diào)研意外檢出BDV，正是流感病毒RT-PCR檢測(cè)的一個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果。我們通過(guò)序列比較，分析這個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果源自流感病毒RTPCR所用的下游引物獨(dú)自引起了這個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果。該引物的3’端與BDV一段序列略有互補(bǔ)（僅有4至5個(gè)核苷酸互補(bǔ)），從而導(dǎo)致在42℃下反轉(zhuǎn)錄時(shí)，對(duì)BDV的RNA序列進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而該引物的3’端還與BDV序列中一段序列比較相似（有5到9個(gè)核苷酸相同），并且位于上述BDV的RNA序列反轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游約600個(gè)核苷酸處。這是產(chǎn)生這種假陽(yáng)性結(jié)果的原因。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析時(shí)，不能發(fā)現(xiàn)該引物與BDV核酸序列同源，因此這種假陽(yáng)性情況在引物設(shè)計(jì)時(shí)無(wú)法預(yù)先避免，并且即便通過(guò)調(diào)整序列避免了這種非特異性擴(kuò)增，卻有可能引起對(duì)其他基因的非特異性擴(kuò)增。因此， RT-PCR檢測(cè)結(jié)果難以作為疫病或感染病診斷的確切依據(jù)。其診斷結(jié)果有時(shí)需要用熒光探針或測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

[1]朱其太.邊界病的研究進(jìn)展[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，1998（4）：32-34.

[2]李文良，毛立，趙永前，等.江蘇部分地區(qū)羊群邊界病流行情況調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（12）：1808-1812.

[3] Li W，Mao L，Zhao Y，et al. Detection of border disease virus（BDV）in goat herds suffering diarrhea in eastern China [J]. Virology Journal，2013，10：80.

[4] Liu X，Mao L，Li W，et al. Genome Sequence of Border Disease Virus Strain JSLS12-01，Isolated from Sheep in China [J]. Genome Announc，2013，1（6）：e00502-13.

[5] Jiang WM，Wang SC，Peng C，et al. Identification of a potential novel type of influenza virus in bovine in China [J]. Virus Genes，2014，49（3）：493-496.

Detection of Border Disease Virus（BDV）in Apparently Healthy Sheep in Shandong

Peng Cheng1，2，Wang Suchun2，Zhuang Qingye2，Hou Gaungyu2，Huang Juan1，Shan Hu1，Chen Jiming2
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109；2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

707 nasal swab samples were collected from apparently healthy cattle and sheep in Shandong province in 2014. RNA was extracted from these samples and detected by RT-PCR using the primers specific to influenza viruses. RT-PCR products of the positive samples were sequenced. Unexpectedly，border disease virus（BDV）was found in one sheep swab sample，which was further confirmed through two RT-PCR assays specific to BDV. It was assumed that BDV likely exist in China，for BDV had been detected in Anhui and Jiangsu provinces in 2012 and live sheep were in frequent movement. The result was also of reference for the analysis of false positive results in various RT-PCR assays. It was suggested that the RT-PCR results hardly provide exact evidences for disease or infection diagnosis. The diagnosis results should be further identified by fluorescence probe or sequencing sometimes.

border disease virus；sheep；RT-PCR；evolution；false positive；Shandong

S852.654

A

1005-944X（2015）03-0001-03

陳繼明，單 虎