劉秋華，羅 曼，彭建宗，王小菁*

(1.廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510631;2.廣東新安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，深圳518052)

GAST(GA-stimulated transcript)是受GA 誘導(dǎo)的一類植物基因家族. 該基因家族編碼蛋白的氨基酸序列具有3個區(qū)域:(1)N 端信號肽區(qū)域，長度約18～29 AA;(2)中間長度不等的親水區(qū)域;(3)C 端高度保守的GASA 區(qū)域(在固定位置包含12個半胱氨酸)，長度約60 AA［1］. Shi 等［2］首次在番茄(Solanumlycopersicum)GA-缺失突變體中發(fā)現(xiàn)GAST1，之后陸續(xù)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)［3-6］、矮牽牛(Petunia hybrida)［7-8］、馬鈴薯(Solanumtuberosum)［9-10］、草 莓(Fragariaananassa)［11-12］、非 洲 菊(Gerbera hybrida)［13-14］、水稻(Oryza sativa)［15-16］、玉米(Zea mays)［17］等植物中克隆得到GAST1 同源基因. 已知，擬南芥GASA 家族有14個成員［5］.GAST 的時空表達(dá)和調(diào)控呈現(xiàn)多樣、復(fù)雜的特征，在植物生長發(fā)育和調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用［18］.

水稻是世界上重要的糧食作物和單子葉模式植物，研究GAST 在水稻中的功能為認(rèn)識赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其調(diào)控水稻的生長發(fā)育分子機(jī)制，指導(dǎo)水稻分子育種，具有重要的科學(xué)理論和生產(chǎn)實踐意義.實驗室前期工作從水稻中克隆了一個GAST 基因家族新成員OsGASR4，本文分析了OsGASR4 的時空表達(dá)模式轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，為深入闡明OsGASR4 在水稻中的生物學(xué)功能提供有用信息和線索.

1 材料與方法

1.1 材料與處理

實驗材料為水稻日本晴品種(Oryza sativa Japonica Group)和赤霉素缺乏突變體d-18［19］，種子由中國水稻所錢前老師提供.

選取14 d 水稻幼苗的根、莖節(jié)、葉，成熟期的旗葉、葉鞘，以及抽穗前期和抽穗后5 d 的穎花和花梗等，用于總RNA 提取，檢測OsGASR4 基因時空表達(dá).

1.2 GA3 處理

挑選種子，在25 ℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，選取15 d 齡的水稻野生型和d-18 突變體幼苗，分別用含有50 μmol/L GA3的木村B 培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，用液氮冷凍保存，用于總RNA 提取.

1.3 序列分析

在NCBI 利用BLAST 檢索OsGASR4 的同源蛋白質(zhì)序列，采用DNAMAN 軟件進(jìn)行多重序列比對和同源性分析. 克隆OsGASR4 啟動子序列，利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PLACE(http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE)分析啟動子區(qū)域中的順式作用元件.

1.4 OsGASR4 基因表達(dá)檢測

按照華越洋生物科技有限公司提供的小量植物RNA 提取試劑盒提取樣品RNA，分別取1 μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系和操作參照Prime-ScriptTMRT Reagent Kit 說明書. 引物合成由上海生物工程公司完成.OsGASR4 及Actin 內(nèi)參基因引物序列:OsGASR4-F:5'-CACTCATCTCCTCACCGTGTTTGTTAG-3';OsGASR4-R:5'-CAACGCTATCAATCACACTACTACCACG-3';OsActin-F:5'-GATGACCCAGATCATGTTTG-3';OsActin-R:5'-TCCTTGCTCATCCTGTCAG-3'.其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純.

PCR 反應(yīng)體系為10 μL，PCR 反應(yīng)程序:94 ℃變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次(OsActin 擴(kuò)增循環(huán)25 次);72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

1.5 OsGASR4 啟動子克隆及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻

根據(jù)序列比對和預(yù)測的結(jié)果，設(shè)計引物:F:5'-CCTTCAGTTTAGCTTGCAAAGACAGGTAATACACACCATATTTCC-3';R:5'-AGATCTACCATGGTCAAGCTTCTCTTGATCCTTTTGAGCTCTAACAAAC-3'. 以水稻基因組DNA 為模板，以高保真的Taq 酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s;55 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min. 瓊脂糖凝膠回收PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序.后轉(zhuǎn)接到pCAMBIA1301 載體上，表達(dá)載體結(jié)構(gòu)如圖1.應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化，以胚性愈傷為轉(zhuǎn)化受體材料，農(nóng)桿菌(OD≈1.0)侵染30 min，共培養(yǎng)3 d 后潮霉素連續(xù)篩選2 次(2 周為1 次)，轉(zhuǎn)移抗性愈傷進(jìn)行預(yù)分化、分化、生根并移栽再生苗.

圖1 OsPGASR4::GUS 表達(dá)載體的構(gòu)建Figure 1 Structure of OsPGASR4::GUS expression vector

1.6 GUS 基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測

選取OsPGASR4::GUS 轉(zhuǎn)基因水稻各個生長時期的組織材料，放入15 mL 離心管中，加入GUS 染色液(50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0;10 mmol/L Na2EDTA;0.1% Triton X100;0.85 g/L 亞鐵氰化鉀;0.65 g/L 鐵氰化鉀;100 mg/L 氯霉素;1 g/L Xgluc)，37 ℃放置過夜，然后用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精脫色，觀察拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 GASA 類蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

將OsGASR4 的蛋白質(zhì)序列與已報道的GASA類蛋白進(jìn)行多重比對，表明OsGASR4 蛋白具有典型的GASA 結(jié)構(gòu)域(圖2).利用DNAMAN 軟件將上述蛋白質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)化樹如圖3 所示.在已研究的GAST 家族成員中，其中OsGASR4 則與Os-GASR1、SNAKIN-1 同源性最高，處于同一個小分枝上，與SNAKIN-1 相似性最高，為41.75%.

圖2 GASA 類蛋白相似性分析Figure 2 Similarity analysis of GASA-like proteins

圖3 GASA 類蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 The phylogenetic tree of GASA-like proteins

2.2 GA3 影響水稻幼苗OsGASR4 表達(dá)

用50 μmol/L 的GA3處理野生型和d-18 突變體水稻幼苗2 h，檢測OsGASR4 基因表達(dá)水平，結(jié)果(圖4)顯示，在野生型和d-18 幼苗中OsGASR4 表達(dá)均受到GA 抑制，GA3處理后表達(dá)量均分別下調(diào)了40%和42%.

2.3 OsGASR4 在水稻的時空表達(dá)

選取水稻日本晴不同發(fā)育時期的組織和器官，包括14 d 幼苗的根、莖、葉，成熟期的旗葉、葉鞘，以及抽穗前期(BH，Before Heading)和抽穗后5 d(5 DAH，5 Days After Heading)的穎花和花梗，用于總RNA 提取，檢測基因的表達(dá)水平(圖5).

在水稻營養(yǎng)生長階段，OsGASR4 在營養(yǎng)生長期14 d 苗的莖節(jié)中表達(dá)較強(qiáng). 水稻進(jìn)入生殖生長期后，OsGASR4 在抽穗前期(孕穗期)的穎花和花梗中都有表達(dá)，抽穗后期(5 DAH)只在穎花中表達(dá).以上結(jié)果說明OsGASR4 基因的表達(dá)在時空上存在特異性.

2.4 OsGASR4 啟動子序列分析與克隆

為了更進(jìn)一步探究OsGASR4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，我們克隆了OsGASR4 的啟動子(ATG 起始密碼子上游2 082 bp).利用數(shù)據(jù)庫PLACE 分析啟動子區(qū)域的順式作用元件(表1)，發(fā)現(xiàn)OsGASR4 啟動子含有啟動子基本元件CAAT BOX，但不含TATA BOX.另外，除了保守的順式元件，OsGASR4 基因啟動子內(nèi)還有一些其他順式元件，如GA、ABA 響應(yīng)元件、核心序列為TGAC 的WRKY710S 元件、種子特異性元件、植物組織相關(guān)元件、光、干旱、寒冷、機(jī)械損傷、熱激等環(huán)境因素相關(guān)元件等.

圖4 GA3 處理野生型和d-18 突變體幼苗2 h OsGASR4 表達(dá)分析Figure 4 Expression of OsGASR4 in seedlings of wild-type and mutant d-18 of rice treated by GA3 for 2 h

圖5 OsGASR4 在水稻中的表達(dá)模式Figure 5 Expression pattern of OsGASR4 in rice

表1 水稻OsGASR4 啟動子中的順式原件預(yù)測Table 1 Predicted cis-elements in the promoter of rice OsGASR4

以水稻基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增后回收擴(kuò)增片段，測序結(jié)果顯示，獲得了長度為2 082 bp 的OsGASR4 上游調(diào)控序列.

2.5 OsGASR4 啟動子驅(qū)動GUS 基因在水稻中的表達(dá)

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻日本晴遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得30 株OsPGASR4::GUS T0轉(zhuǎn)基因植株，PCR 檢測后25 株為陽性. 以陰性植株為對照，分別選取陽性植株和陰性植株的的根、莖、葉、鞘、穗，分析GUS 組織化學(xué)染色情況(圖6). 結(jié)果表明，水稻OsGASR4 啟動子在側(cè)根、莖、葉、葉鞘、花絲、幼穗的枝梗和穎殼中都有表達(dá)，其中在莖和幼穗中的表達(dá)較強(qiáng).

3 討論

圖6 轉(zhuǎn)OspGASR4 基因植株GUS 組織化學(xué)檢測Figure 6 Histochemical GUS staining of tissues from transgenic rice expressing OspGASR4

GAST 家族蛋白在多種雙子葉植物和單子葉植物中均有報道.例如，番茄中RSI-1 基因參與了根的發(fā)育［22］.AtGASA4 在擬南芥的花芽中表達(dá)，可能與細(xì)胞分裂有關(guān)［1］. 草莓中FaGAST 基因在成熟的果實 中大量表達(dá)［11］. 玉米ZmGSL1 參與了側(cè)根的生成［17］.從OsGASR4 蛋白質(zhì)與報道的GAST 類蛋白進(jìn)行多重序列比對結(jié)果看出(圖2)，GAST 蛋白的C末端含有保守的、典型的GAST 結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化過程中該區(qū)域內(nèi)的12 半胱氨酸位置高度保守，可能決定了該類蛋白在結(jié)構(gòu)或功能的生化方面角色;GAST蛋白的N 末端，氨基酸組成和數(shù)目多變，可能是促成GAST 蛋白功能多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ). 在系統(tǒng)發(fā)育樹上OsGASR1 和馬鈴薯SNAKIN-1 與水稻OsGASR4位于同一亞組，同源性最高.OsGASR1 參與了細(xì)胞的增殖，在水稻葉及莖的分生組織和穗部表達(dá)水平高［15］，結(jié)合圖OsGASR4 表達(dá)模式(圖5)和轉(zhuǎn)Osp-GASR4 基因植株GUS 組織化學(xué)染色(圖6)可以看出OsGASR4 在莖和幼穗中表達(dá)量相對較高.植物病原菌可以誘導(dǎo)馬鈴薯SNAKIN-1 的表達(dá)［10］，而Os-GASR4 也可能參與了水稻的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑. 因此推測OsGASR4 可能在水稻圓錐花序發(fā)育及水稻病蟲害防御中發(fā)揮作用.

GAST 基因家族成員表達(dá)受外源GA 調(diào)控，出現(xiàn)3 種情況，擬南芥AtGASA1、AtGASA4、AtGASA6、AtGASA7、AtGASA8、AtGASA13 和AtGASA14［4-6］，山毛櫸FsGASA4［20］，矮牽牛GIP1、GIP2、GIP4 和GIP5［7］，水稻OsGSR1、OsGASR1 和OsGASR2［15-16］和 玉 米ZmGSL1［17］基因轉(zhuǎn)錄水平受GA 誘導(dǎo)上調(diào).第2 種情況是，GA 處理下調(diào)擬南芥AtGASA5，AtGASA9，AtGASA11［6］和馬鈴薯SNAKIN-2［9］基因的表達(dá). 而AtGASA10 和AtGASA12 基因表達(dá)不受GA 處理的影響［6］.

另外ABA 處理誘導(dǎo)AtGASA2、AtGASA3 和AtGASA14 基因表達(dá)，AtGASA9 轉(zhuǎn)錄水平則受ABA 抑制［21］.OsGSR1 轉(zhuǎn)錄水平同時受GA 和BR 影響，介導(dǎo)了GA 信號途徑和BR 信號途徑的交叉［16］. Os-GASR4 啟動子順式元件存在GA 響應(yīng)元件，野生型和GA 缺失的d18 突變體經(jīng)GA 處理后OsGASR4 轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)下降(圖4)，表明該基因表達(dá)與內(nèi)源GA水平無關(guān)，其編碼蛋白可能作為負(fù)調(diào)控因子參與GA 信號途徑的調(diào)控. OsGASR4 啟動子中同時存在ABA 響應(yīng)元件、光調(diào)控響應(yīng)元件以及傷害誘導(dǎo)響應(yīng)元件等，暗示其可能調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以此調(diào)控水稻多個生長發(fā)育過程.水稻OsGASR4 基因的功能有待于利用正向和反向遺傳學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法進(jìn)一步驗證.

［1］Aubert D，Chevillard M，Dorne A M，et al. Expression patterns of GASA genes in Arabidopsis thaliana:The GASA4 gene is up-regulated by gibberellins in meristematic regions［J］. Plant Molecular Biology，1998，36:871 -883.

［2］Shi L，Gast R T，Gopalraj M，et al. Characterization of a shoot-specific，GA3-and ABA-regulated gene from tomato［J］. Plant Journal，1992，2:153 -159.

［3］Peng J Z，Lai L J，Wang X J. PRGL:A cell wall proline-rich protein containning GASA domain in Gerbera hybrida［J］. Science in China Series C-life Sciences，2008，51:520 -525.

［4］Herzog M，Dorne A M，Grellet F. GASA，a gibberellinregulated gene family from Arabidopsis thaliana related to the tomato GAST1 gene［J］. Plant Molecular Biology，1995，27:743 -752.

［5］Roxrud I，Lid S E，F(xiàn)letcher J C，et al. GASA4，one of the 14-member Arabidopsis GASA family of small polypeptides，regulates flowering and seed development［J］.Plant Cell Physiology，2007，48:471 -483.

［6］Sun S，Wang H，Yu H，et al. GASA14 regulates leaf expansion and abiotic stress resistance by modulating reactive oxygen species accumulation［J］. Journal of Experimental Botany，2013，64:1637 -1647.

［7］Ben-Nissan G，Lee J Y，Borohov A，et al. GIP，a Petunia hybrida GA-induced cysteine-rich protein:a possible role in shoot elongation and transition to flowering［J］.Plant Journal，2004，37:229 -238.

［8］Ben-Nissan G，Weiss D. The petunia homologue of tomato gast1:transcript accumulation coincides with gibberellin-induced corolla cell elongation［J］. Plant Molecular Biology，1996，32:1067 -1074.

［9］Berrocal-Lobo M，Segura A，Moreno M，et al. Snakin-2，an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection［J］. Plant Physiology，2002，128:951 -961.

［10］Segura A，Moreno M，Madueno F，et al. Snakin-1，a peptide from potato that is active against plant pathogens［J］. Molecular Plant-microbe Interactions，1999，12:16-23.

［11］De La Fuente J I，Amaya I，Castillejo C，et al. The strawberry gene FaGAST affects plant growth through inhibition of cell elongation［J］. Journal of Experimental Botany，2006，57:2401 -2411.

［12］Moyano-Canete E，Bellido M L，Garcia-Caparros N，et al. FaGAST2，a strawberry ripening-related gene，acts together with FaGAST1 to determine cell size of the fruit receptacle［J］. Plant Cell Physiology，2013，54:218 -236.

［13］Kotilainen M，Helariutta Y，Mehto M，et al. GEG participates in the regulation of cell and organ shape during corolla and carpel development in gerbera hybrida［J］.Plant Cell，1999，11:1093 -1104.

［14］Peng J Z，Lai L J，Wang X J. PRGL:A cell wall proline-rich protein containning GASA domain in Gerbera hybrida［J］. Science in China Series C-life Sciences，2008，51:520 -525.

［15］Furukawa T，Sakaguchi N，Shimada H. Two OsGASR genes，rice GAST homologue genes that are abundant in proliferating tissues，show different expression patterns in developing panicles［J］. Genes ＆ Genetic Systems，2006，81:171 -180.

［16］Wang L，Wang Z，Xu Y Y，et al. OsGSR1 is involved in crosstalk between gibberellins and brassinosteroids in rice［J］. Plant Journal，2009，57:498 -510.

［17］Zimmermann R，Sakai H，Hochholdinger F. The gibberellic acid stimulated-like gene family in maize and its role in lateral root development［J］. Plant Physiology，2010，152:356 -365.

［18］Nahir?ak V，Almasia N，Hopp H E，et al. Snakin/GASA proteins:Involvement in hormone crosstalk and redox homeostasis［J］. Plant Signal Behavior，2012，7:1004-1008.

［19］Itoh H，Ueguchi-Tanaka M，Sentoku N，et al. Cloning and functional analysis of two gibberellin 3 beta-hydroxylase genes that are differently expressed during the growth of rice［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2001，98:8909 -8914.

［20］Alonso-Ramirez A，Rodriguez D，Reyes D，et al. Evidence for a role of gibberellins in salicylic acid-modulated early plant responses to abiotic stress in Arabidopsis seeds［J］. Plant Physiology，2009，150:1335 -1344.

［21］Zhang S C，Wang X J. Expression pattern of GASA，downstream genes of DELLA，in Arabidopsis［J］. Chinese Science Bulletin，2008，53:3839 -3846.