徐 雷 劉朝選

姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞熱休克蛋白27表達(dá)的影響※

徐 雷 劉朝選

目的 探討姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞熱休克蛋白27（HSP27）表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，隨機(jī)將其分為4組，空白對(duì)照組不給藥；大劑量組給予50 μmol/L姜黃素2 μl；小劑量組給予25 μmol/L姜黃素2 μl；陰性對(duì)照組給予等體積二甲基亞砜（DMSO）。采用免疫熒光染色檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27的表達(dá)情況，采用RT-PCR檢測(cè)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，姜黃素治療組PC-3細(xì)胞HSP27染色強(qiáng)度明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，并且大劑量組 HSP27染色強(qiáng)度降低更加明顯，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RT-PCR分析結(jié)果顯示，姜黃素治療組PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA的表達(dá)明顯降低（50%和60%），且呈劑量依賴性，與空白對(duì)照組比較（128%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素可抑制PC-3細(xì)胞HSP27的表達(dá)，可能是其抗前列腺癌的機(jī)制之一。

姜黃素；前列腺癌；PC-3細(xì)胞；熱休克蛋白27

HSP27是熱休克蛋白（heat shock proteins,HSP）亞家族成員之一，在多種腫瘤細(xì)胞中均有過表達(dá)，其主要的生物學(xué)功能是防止各種應(yīng)激因素對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí)，HSP27與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)[1]。目前HSP27與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但有關(guān) HSP27在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中所起的作用鮮見報(bào)道。姜黃素（curcumin）是從中藥姜黃中提取的活性成分，有廣泛的藥理作用，如抗炎、抗氧化抑制血管生成及特有的抗腫瘤活性[2]。本研究旨在觀察姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP27表達(dá)的影響，探討姜黃素抗前列腺癌的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 姜黃素和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司；人前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；F12培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自武漢凌飛科技有限公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自上海華舜公司；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bestbio公司；兔抗小鼠HMGBl抗體和驢抗兔lgG購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；青霉素、鏈霉素和溴化乙啶等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（北京化工廠）。姜黃素使用二甲基亞砜（DMSO）配制成50 mmol/L儲(chǔ)備液，-20C冰箱保存?zhèn)溆?，臨用前用F12培養(yǎng)液分別配制成25 μmol/L和50 μmol/L溶液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PC-3細(xì)胞保存在含有 10%胎牛血清的F12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（含青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml）。按照細(xì)胞密度1×106個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% 二氧化碳（CO2）及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟至少重復(fù)4次。

1.3 分組及治療方法 待80%細(xì)胞融合后，更換新鮮培養(yǎng)液，并加入不同濃度姜黃素，體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞，隨機(jī)將其分為4組，空白對(duì)照組不給藥；大劑量組給予50 μmol/L姜黃素2 μl；小劑量組給予25 μmol/L姜黃素2 μl；陰性對(duì)照組給予等體積DMSO。收集培養(yǎng)液用于后續(xù)分析，進(jìn)行免疫熒光染色和RT-PCR檢測(cè)。

1.4 免疫熒光染色 常規(guī)方法收獲細(xì)胞、胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，TCM-N3沖洗，50 ml錐形管2000 rpm離心10 min（離心半徑r=8.5 cm）。將上清液吸出并重新懸浮于1 ml TCM-N3，滴于載玻片（多聚賴氨酸包被）上吹干，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌5 min，共5次。滴加5 g/L牛血清清蛋白（BSA）封閉液，37 ℃封閉 30 min，加入相應(yīng)的一抗，兔抗小鼠HMGBl抗體（1∶200），PBS洗滌5 min，共5次。加入熒光標(biāo)記的二抗，PE標(biāo)記的驢抗兔 lgG（1∶500），避光，37℃孵育2 h，PBS洗滌5 min，共5次。Hoechst 33342染料避光37 ℃孵育15 min，PBS洗滌，共3次。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。

1.5 RT-PCR檢測(cè)HSP27mRNA的表達(dá) 按照說明書，TRIzol試劑盒抽提總 RNA，溶于 20 μl DEPC-H2O，依次加入2.5 μL DNA酶，2.5 μl 10×緩沖液，37 ℃水浴30 min后，65 ℃水浴10 min，分光光度法檢測(cè)RNA濃度。HSP27PCR引物是：5'-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3'（正向）和 5'-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3'（反向），GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物：5'-GGTCAACGGGTAGG TGTTTG-3'（正向）和5'-GCCTTTGGGCTCTGCAT GAA-3'（反向）。HSP27 PCR反應(yīng)總體積25 μl。使用GeneAmp 2400熱循環(huán)儀，預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，35 mA，30 min），溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進(jìn)行電泳結(jié)果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達(dá)相對(duì)含量值（灰度比）= HSP27吸光度積分值/GAPDH吸光度積分值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC-3細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯高于大劑量組和小劑量組，且大劑量組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度降低更加明顯，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 PC-3細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果

2.2 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平明顯升高，分別為128%和110%；給予姜黃素干預(yù)后，PC-3細(xì)胞的HSP27 mRNA表達(dá)水平明顯降低，分別為50%和60%，且大劑量組降低更加明顯，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 姜黃素對(duì)PC-3細(xì)胞HSP27 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

HSP是應(yīng)激條件下產(chǎn)生的高度保守的分子伴侶[3]，是組織和器官受到刺激或應(yīng)激時(shí)表達(dá)的主要蛋白質(zhì)，可參與細(xì)胞損傷、防御、修復(fù)產(chǎn)生而控制細(xì)胞功能[4]。HSP的表達(dá)可抑制細(xì)胞損傷，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)也起到重要作用，如控制細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫反應(yīng)[5]。正常組織細(xì)胞內(nèi) HSP27的表達(dá)水平很低。應(yīng)激狀態(tài)可致胞內(nèi)HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達(dá)上調(diào)。Miyake等[6]報(bào)道，HSP27、HSP70、HSP90在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)，根據(jù)Gleason評(píng)分和病理分期，只有HSP27表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且HSP27可作為前列腺癌預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組HSP27陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度明顯增高。研究結(jié)果[6]與其相一致。

姜黃素是一種從姜黃根莖中提取得到的脂溶性酚類黃色色素，具有重要和廣泛的藥理作用，如抗突變、抗炎和抗腫瘤等多種作用等[7-8]。姜黃素對(duì)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均有明顯抑制效果，有多靶向的抗腫瘤作用。目前，姜黃素的抑瘤作用機(jī)制主要與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，其通過調(diào)控抑癌基因，癌基因及其蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)等途徑實(shí)現(xiàn)的[9]。RT-PCR技術(shù)檢測(cè)姜黃素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞HSP 27 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，姜黃素可抑制HSP 27 mRNA的表達(dá)，且隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，具有劑量依賴性。綜上所述，PC-3細(xì)胞HSP 27 mRNA表達(dá)水平明顯增高，而姜黃素可以抑制 PC-3細(xì)胞 HSP 27 mRNA表達(dá)，高濃度的姜黃素抑制作用更強(qiáng)，為尋找治療治療靶位提供了基礎(chǔ)。有關(guān)姜黃素對(duì)前列腺癌細(xì)胞的凋亡是否有影響，有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Curcumin on Heat Shock Protein27 Expression in Prostate Cancer PC-3 cell

Xu Lei Liu Chaoxuan

Objective To explore the effect of curcumin on heat shock protein27(HSP27) expression in prostate cancer PC-3 cell.Methods human prostate cancer PC-3 cell cultured in vitro were randomly divided into four groups:control group:without curcumin;high-dose group:50 μmol/L curcumin 2 μl;low-dose group:25 μmol/L curcumin 2 μl;separate negative control group:given equal volume dimethyl.Using immunofluorescence staining detected HSP27 expression in PC-3cell,Using RT-PCR detected HSP27mRNA expression in PC-3 cell. Results Immunofluorescence staining showed that the staining forHSP27 in PC-3 cells was significantly lower in the curcumin treatment group than the control group and the negative group,and the staining forHSP27 in PC-3 cells in the high-dose group decreased more significantly,compared with the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05).And the HSP27 mRNA expression detected by RT-PCR was stronger in the high-dose group compared with that in the low-dose group,compared with the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion Curcumin inhibited HSP27 expression in PC-3 cells may be one mμ echanism of its anti- prostate cancer.

Curcumin;Prostate Cancer;PC-3 cell;Heat shock protein 27

R737.25

A

1673-5846(2015)01-0015-03

牡丹江市第一人民醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江 157011

黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目“姜黃素治療前列腺癌的機(jī)制研究”（編號(hào)：ZHY13-W62）

徐雷（1978-），主治醫(yī)師，研究方向：前列腺癌發(fā)生機(jī)制及生物學(xué)研究。E-mail：leixu1978@126.com