李 杰，歐余航，陳 強(qiáng)

(1.中國(guó)人民解放軍第175醫(yī)院，福建漳州 363000;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122)

復(fù)方九節(jié)茶乳膏是由九節(jié)茶和冰片配伍制成的外用乳膏劑，具有消炎止痛的功效。方中九節(jié)茶為金粟蘭科植物草珊瑚(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)的干燥地上部分［1］。其味辛、苦，功專清熱解毒，活血散瘀通絡(luò)，為君藥;配以冰片清熱消腫止痛［2］，又能促透皮吸收;二藥合用共奏“舒筋活血、消腫止痛”之功。草珊瑚屬植物中的香豆素類(如異嗪皮啶)具有消炎、止痛等活性［3－5］，采用薄層色譜法對(duì)異嗪皮啶進(jìn)行定性鑒別;有機(jī)酸是中草藥抗菌消炎活性成分［6－11］，以反丁烯二酸和迷迭香酸為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法建立其含量測(cè)定方法［12－14］;方中另一味主藥冰片采用薄層色譜法對(duì)其定性鑒別，旨在建立有效的可控制該制劑質(zhì)量的方法。

1 材料與試劑

Waters高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)、XS105電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)、CP214電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、1-14離心機(jī)(德國(guó) sigma)、TDL-80-2B臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、數(shù)控超聲波提取器(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司)、Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)、薄層硅膠G板。

復(fù)方九節(jié)茶乳膏(批號(hào):20120814、20120815、20120816)、乳膏基質(zhì)(自制)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 九節(jié)茶鑒別 取復(fù)方九節(jié)茶乳膏1 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲30 min溶解，冰浴2 h，離心30 min，取上清液，濃縮至約1 mL，作為供試品溶液。按處方組成，取除九節(jié)茶浸膏外的其余藥味與基質(zhì)按復(fù)方九節(jié)茶乳膏工藝條件制備陰性樣品，依供試品溶液的制備方法操作，制得陰性對(duì)照溶液。再取九節(jié)茶浸膏約0.1 g，加水10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為九節(jié)茶浸膏溶液。另取異嗪皮啶對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(2010版藥典一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯—乙酸乙酯—甲酸(9∶4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

2.1.2 冰片鑒別 取復(fù)方九節(jié)茶乳膏約1 g，置具塞試管中，加入無(wú)水乙醇8 mL，水浴50℃，溶解，冰浴 30 min，離心(3 500 r·min－1)15 min，取上清液，備用;取冰片對(duì)照品加入無(wú)水乙醇制成濃度為2 g·L－1的溶液，作為對(duì)照品溶液;取九節(jié)茶乳膏(不含冰片)，依供試品溶液的制備方法操作，制得陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(2010版藥典一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。展開劑為石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯(9∶1)，展開，取出，晾干。噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用Kromasil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫30℃，以流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈溶液(B)—0.1%甲酸水溶液(D)進(jìn)行梯度洗脫［0～10 min，5%B→20%B;10 ～25 min，20%B;25 ～30 min，20%B→5%B;30 ～35 min，5%B］，流速為1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm和330 nm，理論板數(shù)按迷迭香酸計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2.2 溶液制備 (1)對(duì)照品溶液的制備:分別精密稱定反丁烯二酸、迷迭香酸對(duì)照品8.16 mg和10.66 mg，置25 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

(2)供試品溶液的制備:取本品約0.25 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇15 mL，稱重，然后于50℃水浴超聲30 min，冷卻至室溫，用60%甲醇補(bǔ)足失重，冰浴1 h，離心(12 000 r·min－1，15 min)，過0.22 μm 濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

(3)陰性對(duì)照品溶液的制備:按處方組成，取除九節(jié)茶浸膏外的其余藥味按復(fù)方九節(jié)茶乳膏工藝條件制備陰性樣品，依(2)供試品溶液的制備方法操作，制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 HPLC 的測(cè)定 按照“2.2.1”色譜條件，分析反丁烯二酸和迷迭香酸對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，結(jié)果見圖3～8。

2.2.4 線性范圍 分別精密吸取上述反丁烯二酸儲(chǔ)備液0.2、0.3、0.5、1、2 mL，分別置10 mL 容量瓶中，并吸取上述迷迭香酸儲(chǔ)備液 0.1、0.2、0.3、0.5、1 mL依次置上述10 mL容量瓶中，加60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，依法測(cè)定。以峰面積A和濃度C繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得迷迭香酸回歸方程:A=56 006C－81 204，r=0.999 5，反丁烯二酸回歸方程:A=104 483C －24 981，r=0.999 9，迷迭香酸、反丁烯二酸分別在 4.26 ～42.64 mg·L－1、6.53 ～65.28 mg·L－1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.2(1)”項(xiàng)下迷迭香酸對(duì)照品溶液0.5 mL和反丁烯二酸對(duì)照品1 mL，置10 mL容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得迷迭香酸的峰面積平均值為1 092 289，RSD=0.26%，反丁烯二酸峰面積的平均值為3 436 871，RSD=0.35%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，配制6份，依“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算得反丁烯二酸平均含量為1 417.35μg·g－1，RSD=1.35%(n=6)，迷迭香酸平均含量為 829.51 μg·g－1，RSD=1.26%(n=6)。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定，得反丁烯二酸的峰面積平均值為2 526 141，RSD=0.73%(n=6)，迷迭香酸的峰面積平均值為 704 233，RSD=1.09%(n=6)，溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取本品約0.125 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，再精密移取迷迭香酸對(duì)照溶液0.3 mL，反丁烯二酸對(duì)照溶液0.6 mL，加60%甲醇至15 mL，稱重，然后于50℃超聲水浴中超聲30 min，冷卻至室溫，用溶劑補(bǔ)足失重，冰浴60 min，離心(12 000 r·min－1，15 min)，過 0.22 μm 濾膜，取續(xù)濾液20μL進(jìn)樣。按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品測(cè)定 取本品，按“2.2.2(2)”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果見表2。

3 討論

為確保乳膏中有效成分含量測(cè)定的準(zhǔn)確性，首先要保證有效物質(zhì)的溶出，就是要使乳膏充分破乳，并給予足夠長(zhǎng)時(shí)間的冰浴，盡量減少基質(zhì)的干擾。在相同的前處理的條件下，考察了不同濃度的甲醇(60%、70%、90%)對(duì)乳膏中指標(biāo)性成分反丁烯二酸和迷迭香酸的提取效果。由于反丁烯二酸的極性相對(duì)較大，60%甲醇對(duì)其溶出效果明顯優(yōu)于90%甲醇，且含量差異較大;迷迭香酸的極性相對(duì)小些，但不同濃度的甲醇對(duì)其溶出效果差異不是很大，結(jié)果綜合考慮兩種指標(biāo)性成分的提取率，最終確定以60%作為提取溶劑。不同提取溶劑的用量的考察(5、10、15 mL)，最終確定為15 mL?？疾觳煌崛r(shí)間，超聲時(shí)間為15、30、45 min，最終確定為30 min。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果

表2 三批試制產(chǎn)品含量檢測(cè)結(jié)果

在測(cè)定波長(zhǎng)選擇時(shí)，首先對(duì)兩種指標(biāo)性成分分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，反丁烯二酸只在210 nm處有最大吸收，迷迭香酸在330 nm處有最大吸收，為更準(zhǔn)確測(cè)定各自的含量，因此借助儀器的DAD檢測(cè)器，雙波長(zhǎng)法測(cè)定二者的含量。

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