潘卉萱，劉建社，張 春，黃 杰

(1.安徽省立醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230001;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北武漢 430022)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是危害人類健康的危重病之一，隨病程進展，建存的腎單位發(fā)生代償性增生，而這種代償性機制可導致腎小球進一步硬化、腎小管間質(zhì)的損傷，腎單位進一步減少，最終進展為慢性腎衰竭。目前對于慢性腎衰竭的療法除營養(yǎng)療法、替代療法、及腎臟移植等治療方法外，尚無其它特效的治療方法。替代療法如血液透析、腹膜透析等方法均不能改善腎組織的病理損害，且有不同程度的副作用，腎移植又存在著腎源缺乏和排斥反應等缺陷;因此深入研究腎間質(zhì)纖維化的機制，控制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展對延緩腎臟疾病的進展至關重要。中醫(yī)藥治療類似腎炎病證的歷史悠久，可改善腎組織血液循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應、調(diào)節(jié)氧化應激，延緩慢性腎臟疾病的進程，在改善慢性腎臟疾病進展方面有一定優(yōu)勢。復方二黃顆粒是有大黃、黃芪、水蛭等組方而成的復方中藥顆粒劑，具有益腎、活血化瘀、補氣、扶正祛濁的功效。本實驗通過觀察復方二黃顆粒劑對腎大部切除腎衰大鼠的腎臟病理的影響，并采用免疫組化法觀察腎組織中TGF-β1(轉(zhuǎn)化生長因子-β1)、FN(纖維連接蛋白)、α-SMA(α-平滑肌肌動蛋白)的表達變化。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠30只，10～12周齡，體重(250±20)g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號:scxk(鄂)2004－2007，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗藥物 復方二黃顆粒劑由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院研制生產(chǎn)，批號20051206。

1.3 實驗試劑 兔抗鼠FN的多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1的多克隆抗體(滴度為 1∶50)、兔抗鼠 α-SMA的多克隆抗體、SP免疫試劑盒、DAB試劑盒(購于博士德公司)。

1.4 實驗儀器 華中科技大學同濟醫(yī)學院千屏HPIAS－2000型圖像儀。

2 實驗方法

2.1 模型制備［1－2］手術組大鼠予用3%戊巴比妥鈉45 mg·kg－1，經(jīng)腹腔注射麻醉后，俯臥固定于溫暖手術臺上，剪毛，從距左脊肋骨1.5 cm處斜向外下方切口，暴露左側(cè)腎臟，分離腎包膜及脂肪后，用絲線離斷結(jié)扎上下級腎組織各約1/3，出血明顯者用明膠海綿壓迫止血片刻，復位腎臟，腹腔注射青霉素每千克72萬單位，逐層縫合。1周后同樣方式切除整個右腎，兩次手術共切除5/6腎臟。假手術組麻醉后切開皮膚及肌肉層，僅分離腎臟包膜，不切除腎臟，手術后，腹腔注射青霉素，逐層縫合。先行切除左腎的2/3，1周后同樣方式切除整個右腎，兩次手術共切除5/6腎臟。假手術組10只僅切開皮膚及肌肉層，僅分離腎臟包膜，不切除腎臟。

2.2 實驗分組 實驗大鼠隨機分為假手術組、模型對照組和藥物治療組，每組各10只，假手術組因麻醉意外死亡1只。根據(jù)藥物臨床用量，計算［3］治療組予以復方二黃顆粒按3.13 g·kg－1灌胃給藥;假手術組和模型對照組每日給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 觀察指標 在藥物灌胃第8周后處死大鼠。取各組大鼠部分腎組織，于光鏡下觀察腎組織的病理變化;對上述組織切片進行 TGF-β1、FN、α-SMA免疫組化染色。

2.4 結(jié)果分析 結(jié)果采用華中科技大學同濟醫(yī)學院千屏HPIAS－2000型圖像分析軟件對腎組織免疫組化結(jié)果進行半定量分析，根據(jù)陽性面積占整個測量面積的百分比，計算出百分率。計算腎組織著色面積與面積的比值。腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)病變指數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后，按連續(xù)變量處理。連續(xù)變量采用(±s)表示，三組定量數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析的方法;三組之間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD-t);計數(shù)資料采用卡方檢驗。P ＜0.05，為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 實驗期間，假手術組大鼠表現(xiàn)機警，反應快，皮毛致密、整齊而有光澤，生長、進食及活動情況均無明顯異常;腎大部切除組明顯營養(yǎng)不良，精神萎靡，活動遲緩，食欲不振，皮毛蓬松、枯槁無光澤，治療組大鼠與假手術組大鼠一般表現(xiàn)無太大差別，只是皮毛干燥無光，活動慢。

3.2 病理改變

3.2.1 雙腎的大體解剖 正常組:雙腎成蠶豆樣外觀，無腫大，顏色紅褐色質(zhì)地堅實有光澤;切面皮質(zhì)紅褐色，髓質(zhì)淺紅色，皮、髓質(zhì)界線清晰;包膜結(jié)合緊，不易剝離。其它兩組與正常組相比，大鼠殘腎代償性肥大，腎臟腫脹、體積增大，呈灰褐色，缺乏光澤，表面有多數(shù)隆起，和周圍組織黏連;切面皮質(zhì)變薄，皮髓質(zhì)分界不清。治療組大鼠腎臟較模型對照組大鼠腎臟顏色稍紅潤，腫脹相對輕，質(zhì)地稍堅實。

3.2.2 顯微鏡觀察腎臟病理改變 假手術組腎小球、腎小管及間質(zhì)無明顯改變，排列分布及形態(tài)均正常。模型對照組大鼠腎小球大小極不一致，大多數(shù)腎小球腫大，包曼囊內(nèi)有多少不等的滲出物，毛細血管球內(nèi)有糖原(PAS)染色紅染物質(zhì)明顯增多沉積于系膜和毛細血管周圍。腎小球有核細胞數(shù)增多，以系膜細胞、內(nèi)皮細胞和足細胞增多為主。系膜基質(zhì)增生。腎小球呈局灶節(jié)段性硬化，腎小管上皮細胞渾濁腫脹，部分小管萎縮、壞死，有管型形成，管腔閉塞或擴張，被纖維組織所取代。腎間質(zhì)大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)纖維組織增生，面積增寬。

與假手術組比較，模型對照組的腎小球積分及腎小管間質(zhì)積分均顯著增高 (P＜0.01);與模型對照組比較，復方二黃顆粒劑可以降低腎小球積分，明顯改善降低腎小管間質(zhì)積分(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠的病理積分(±s)

表1 各組大鼠的病理積分(±s)

注:與假手術組比較，△P＜0.01;與模型對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 。

組別 n 腎小球積分 腎小管間質(zhì)積分假手術組9 0.18 ±0.09 0.35 ±0.18模型對照組 10 0.82±0.34△ 1.32±0.41△治療組 10 0.40±0.51＊＊ 0.64±0.37*

3.2.3 復方二黃顆粒劑對腎組織 TGF-β1、FN、α-SMA表達的影響 假手術組中，TGF-β1的陽性表達僅在少數(shù)腎小管主要在上皮細胞內(nèi)有微量表達，以胞漿著色為主，腎小球有少量表達。模型對照組TGF-β1主要表達于腎小球基底膜和臟層上皮細胞，萎縮或擴張的腎小管上皮細胞，尤其在腎間質(zhì)有單核細胞浸潤處的遠端和近端腎小管上皮細胞內(nèi);部分內(nèi)皮細胞和系膜區(qū)也可見少量陽性表達。

假手術組中，F(xiàn)N僅少量表達于腎間質(zhì)基質(zhì)及腎小球中，主要表現(xiàn)為系膜基質(zhì)、腎小管基底膜出現(xiàn)極少量棕黃色顆粒。而模型對照組中，F(xiàn)N在系膜基質(zhì)、腎小管上皮細胞基底部、腎小管間質(zhì)表現(xiàn)出強陽性表達，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒。

假手術組中，α-SMA僅在血管平滑肌細胞呈陽性表達，腎小球、腎小管及間質(zhì)偶見陽性表達;模型對照組中，α-SMA表達主要在皮質(zhì)區(qū)及皮髓交界處的腎小管及間質(zhì)區(qū)的細胞漿，部分腎小管上皮細胞及其周圍間質(zhì)區(qū)表達明顯，且與局部間質(zhì)增寬及腎小管病變程度一致;在腎小球內(nèi)可見少量表達，以腎小球血管極多見。

與假手術組比較，模型對照組大鼠腎組織中TGF-β1、FN、α-SMA 的表達顯著增強(P ＜0.01);與模型對照組比較，治療組大鼠腎組織中 TGF-β1、FN、α-SMA的表達顯著降低 (P＜0.01)。見表2、圖2～4。

表2 各組大鼠腎組織免疫組化檢測結(jié)果比較(±s)/%

表2 各組大鼠腎組織免疫組化檢測結(jié)果比較(±s)/%

注:與假手術組比較，△P ＜0.01;與模型對照組比較，*P ＜0.01。

組別 n TGF-β1 FN α-SMA假手術組9 1.78 ±0.43 1.17 ±0.34 0.78 ±0.41模型對照組 10 9.12 ±0.71△ 9.35 ±1.52△ 10.65 ±1.54△治療組 10 4.65 ±0.57* 5.47 ±0.81* 6.22 ±0.63*

4 討論

醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，慢性腎衰竭最終導致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，促使CKD進展的機制眾多，腎單位的高濾過、高代謝、腎組織上皮細胞表型轉(zhuǎn)分化、細胞因子過度分泌、氧化應激等因素均可加重腎損害，并且，各種因素互為因果、相互影響形成一個復雜的網(wǎng)絡。在復雜的細胞因子網(wǎng)路中，TGF-β1是最關鍵的促纖維化生長因子，它可刺激膠原、纖維連接蛋白(FN)、蛋白多糖的表達，促進ECM的產(chǎn)生同時抑制其的降解。同時，許多過度表達的細胞因子都通過TGF-β1介導膠原沉積引起腎纖維化［4－6］。FN是ECM成分中變化最早、最敏感的促腎小球硬化成分，其合成增加在一定程度上代表了ECM的過度積聚。同時FN也是一種重要的調(diào)理介質(zhì)，局部FN和膠原的堆積又促進成纖維細胞、腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞的增殖、轉(zhuǎn)分化及腎臟纖維化的形成［7－8］。α-SMA是多種腎臟固有細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的標志性蛋白。正常腎臟組織中，僅血管平滑肌細胞強陽性表達α-SMA，其它腎臟固有細胞通常不明顯表達α-SMA;病理狀態(tài)下，腎組織出現(xiàn)病理損傷后α-SMA表達上調(diào)，導致腎臟固有細胞被激活出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化，表明腎臟固有細胞由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖表型或分泌表型，腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)成纖維細胞等表達α-SMA標志著它們被激活和異常增殖，具有肌成纖維細胞的特征，即發(fā)生了細胞表型轉(zhuǎn)化;同時，轉(zhuǎn)分化的細胞又主動合成和分秘細胞外基質(zhì)(ECM)，表達并自分泌多種炎癥介質(zhì)，促進腎小球硬化、間質(zhì)纖維化［9］。

中醫(yī)中藥是我國治療腎臟疾病的特色，中醫(yī)學認為慢性腎衰竭是病位以腎為主并累及多個臟腑，其基本病機是本虛標實;本虛以腎元虧虛為主，標實為水氣、濕濁、濕熱、血瘀、肝風之證，目前許多中醫(yī)研究表明瘀血、濁毒、濕熱、水濕都參與了疾病的全過程。中醫(yī)的“血瘀”涵蓋了腎小球血管病變、基質(zhì)增多、固有細胞轉(zhuǎn)分化、腎小管間質(zhì)纖維化等病理變化。而活血和絡、泄?jié)峤舛?、清利濕熱等方法治療均有效。復方二黃顆粒根據(jù)中醫(yī)對慢性腎衰竭“虛、瘀、毒、濁”組方，主要由大黃、黃芪、水蛭等組成。大黃是掌葉大黃、藥用大黃、唐古特大黃的干燥根或根莖，具有降泄、排濁毒、祛瘀生新等作用。大黃可增加氮質(zhì)從腸道排出，減輕患者的氮質(zhì)血癥，并具有改善患者血液的高凝狀態(tài)、抑制腎臟固有細胞增殖、減少腎組織ECM聚積、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂等作用［10－12］。黃芪是內(nèi)蒙黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，含有黃芪皂甙、黃芪總黃酮、黃芪多糖、多種氨基酸等有效成分，具有益氣固本、利尿消腫等功效。黃芪具有雙向免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能，還可改善腎臟微循環(huán)、促進腎組織對有害抗原的清除、促進腎小球基底膜的修復、減輕腎組織的氧化應激反應、抑制細胞凋亡，從而保護腎功能［12－14］。水蛭具有破血，逐瘀，利水功效，其含有水蛭素、肝素和抗血栓素等活性成分，具有抗凝、抗血栓形成、降低血液黏稠度、改變血液流變學的作用，且水蛭素還可減輕腎小球系膜細胞增生、減少纖維蛋白沉積，從而可延緩腎衰竭的進展［15］。

本實驗觀察到，復方二黃顆粒改善了腎大部切除后慢性腎衰竭大鼠的生活狀態(tài)及殘腎的腎臟病理改變，降低了殘腎組織中 TGF-β1、FN、α-SMA的表達，減少ECM的聚集，減輕腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，延緩慢性腎衰竭的進展，對慢性腎衰竭大鼠腎臟具有一定的保護作用。其作用機制可能與部分下調(diào)腎臟下調(diào)TGF-β1、FN、α-SMA的表達，減少細胞外基質(zhì)的過度沉積，減少腎臟固有細胞的轉(zhuǎn)分化，減少腎小球內(nèi)細胞增生等作用有關。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果顯示，復方二黃顆?？梢灶A防性阻止殘余腎組織的代償性增生和肥大，延緩腎小球硬化、抑制腎臟纖維化。對臨床上中西藥聯(lián)合治療延緩慢性衰竭進展具有一定的參考意義。

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