楊曉娜，徐 玲，*，趙昶靈，尹卓平

（1.保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.龍陵石斛研究所，云南 保山 678300）

龍陵紫皮石斛色素的提取及其穩(wěn)定性

楊曉娜1，徐 玲1，*，趙昶靈2，尹卓平3

（1.保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.龍陵石斛研究所，云南 保山 678300）

以3 種類型的龍陵紫皮石斛（Dendrobium devonianum）莖為試材，用溶劑法提取色素，并研究其穩(wěn)定性。結(jié)果表明：3 種類型龍陵紫皮石斛色素溶液在可見光533.0 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，其色素的主要成分為花色苷。紫鞘型、紫條型和血草型紫皮石斛花色苷含量分別為39.65、35.05、15.85 mg/L。溫度的改變對(duì)紫皮石斛花色苷影響較大，隨著溫度升高，顏色逐漸加深；在陽光照射下，花色苷極不穩(wěn)定，Mg2+和Al3+對(duì)花色苷有很好的增色、穩(wěn)定作用；Cu2+、Zn2+和Fe3+使花色苷明顯褪色，并伴有沉淀；隨著H2O2和VC、Na2SO3濃度的增大，顏色逐漸消退；食鹽對(duì)紫皮石斛花色苷有一定的增色作用；蔗糖和檸檬酸使花色苷明顯褪色。

紫皮石斛；花色苷；提取；鑒定；穩(wěn)定性

紫皮石斛是以齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt.）為代表的一類蘭科石斛屬植物，屬附生多年生草本，是近年來開發(fā)利用的藥用佳品，主要分布于中國(guó)的云南、貴州等省，緬甸、越南、泰國(guó)等地[1]。云南省龍陵縣是最早實(shí)現(xiàn)紫皮石斛人工栽培的縣[2]，其代表種為齒瓣石斛，主要分布于龍山、龍江、象達(dá)、平達(dá)、木城等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，該類石斛以莖條紫紅色為顯著特征。經(jīng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其在種植過程中出現(xiàn)5 種變異類群（血草型、紫鞘型、紫條型、鐵線草型和綠殼型），其中紫鞘型、紫條型、血草型莖紫化現(xiàn)象較為明顯，富含天然色素。

花色苷類化合物是類黃酮合成途徑的有色末端產(chǎn)物，是影響花和果實(shí)的主要色素[3]，不僅不存在安全性問題，而且具有輔助降血脂[4]、降低冠狀動(dòng)脈心臟病發(fā)病率、調(diào)理血液循環(huán)的紊亂、治療糖尿病和口腔潰瘍[5]、緩解視疲勞[5]、抗衰老、抗腫瘤、抗病原體、抗炎、保護(hù)胃免受損傷[6]等生理功能。大量的流行病學(xué)研究證明食物中的花色苷和植物多酚對(duì)人類許多疾病有預(yù)防和治療作用[6]。隨著科技的發(fā)展，人們對(duì)食品添加劑的安全性越來越重視，合成色素的使用種類和數(shù)量已經(jīng)大幅度下降[7]。因此，開發(fā)和應(yīng)用天然色素已成為世界食用色素發(fā)展的總趨勢(shì)。

紫皮石斛作為保山重要的植物資源，雖已證明其富含多糖、氨基酸、礦物質(zhì)、生物堿等，但對(duì)紫皮石斛花色苷的鑒定及穩(wěn)定性鮮有報(bào)道。為充分利用紫皮石斛植物資源，本研究用溶劑法提取紫鞘型、紫條型、血草型紫皮石斛花色苷，并進(jìn)行鑒定和穩(wěn)定性分析，旨在為紫皮石斛的天然色素開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用新鮮、無病蟲害、無霉?fàn)€的紫鞘型、紫條型、血草型紫皮石斛莖（圖1）作試材，采購自龍陵縣紫皮石斛人工種植基地，除葉后于—20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 紫皮石斛及其橫切面Fig.1 Cross sections of Dendrobium devoninum stems

甲醇、乙醇、鹽酸、乙酸、石油醚、氯仿、丙酮、甲苯、乙酸乙酯、亞硫酸鈉、氯化鐵、氨水、碳酸鈉、氫氧化鈉、氯化鎂、氯化鋁、硫酸銅、氯化鉀、氯化亞鐵、氯化鐵、氯化鈣、氯化鉛、VC、過氧化氫、亞硫酸鈉、食鹽、蔗糖、檸檬酸（均為分析純） 昆明云科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（配有特制的流體消聲器） 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（配有國(guó)外先進(jìn)變頻控制系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)） 上海亞榮生化儀器廠；UV5000紫外-可見分光光度計(jì)（配有計(jì)算機(jī)操作系統(tǒng)，防水式7寸大屏幕觸摸和進(jìn)口硅光二極管） 安徽皖儀科技股份有限公司；CP系列電子天平（配有100 g校準(zhǔn)砝碼） 上海奧豪斯儀器有限公司；PHS-25 pH儀（配有“定位”、“溫度補(bǔ)償”外，還設(shè)有“斜率調(diào)節(jié)”，可對(duì)電極轉(zhuǎn)換系數(shù)進(jìn)行校正） 上海虹益儀器儀表有限公司；DK-8AX型電熱恒溫水槽（配有三組獨(dú)立的水槽和相應(yīng)的控溫設(shè)備） 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶劑法提取紫皮石斛花色苷

將以上3 種類型紫皮石斛從—20 ℃冰箱取出，紫鞘型（取紫色分布區(qū)域）、紫條型（取紫色分布區(qū)域）、血草型（整株）各稱取100 g，均切成約1～2 cm長(zhǎng)，1～2 mm厚的片段，置于1 000 mL體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸-甲醇溶液中，標(biāo)記后于4 ℃冰箱浸提24 h后過濾。將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮（溫度＜40 ℃），并回收甲醇，將濃縮液于棕色瓶4 ℃保存以待備用。

1.3.2 紫外-可見光譜分析方法

將3 種類型紫皮石斛色素提取液用紫外-可見分光光度計(jì)在200～690 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，獲得紫外-可見圖譜[8]。

1.3.3 理化性質(zhì)鑒定方法[9]

1.3.3.1 溶解性測(cè)定

吸取3 份乙酸、石油醚、水、80%乙醇、氯仿、丙酮、甲苯、乙酸乙酯各10 mL，分別加3 種類型紫皮石斛色素濃縮液3 滴，觀察溶解情況。

1.3.3.2 顏色反應(yīng)

取紫皮石斛提取液10 mL，加入幾滴Na2SO3溶液，振蕩，觀察溶液顏色變化情況，然后再加入幾滴濃鹽酸，振蕩，觀察顏色變化情況；取紫皮石斛提取液10 mL，逐滴加入3% FeCl3溶液，振蕩，觀察顏色變化情況。將紫皮石斛提取液滴在濾紙上，置于濃氨水上方，觀察顏色變化情況；將紫皮石斛提取液滴在濾紙上，加幾滴飽和Na2CO3溶液，放置空氣中觀察顏色變化情況；取紫皮石斛提取液20 mL 14 份，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將花色苷提取液配制為pH 1.0～14.0的溶液，觀察溶液顏色變化情況。

1.3.4 紫皮石斛提取液中花色苷含量測(cè)定

用pH示差法測(cè)定[10]，分別取紫鞘型、紫條型、血草型樣品5 mL，分別用pH 1.0的KCl（0.2 mol/L KCl與0.2 mol/L HCl體積比為25∶67 ）和pH 4.5的乙酸鈉緩沖液（1 mol/L CH3COONa、1 mol/L HCl和H2O體積比為100∶60∶90）定容至25 mL，室溫下平衡20 min，分別測(cè)定兩樣品在533 nm和700 nm波長(zhǎng)處的吸光度。吸光度及紫皮石斛提取液中花色苷含量（ρ）計(jì)算公式如下。

式中：MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量，為449.2 g/mol；DF為稀釋因子，此處為5；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)，此處為26 900 L/（cm·mg）；l為比色皿厚度/cm。

1.3.5 穩(wěn)定性測(cè)定[11]

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性

分別取200 mL稀釋了10 倍的紫鞘、紫皮和血草花色苷提取液7 份，分別裝于21 個(gè)碘量瓶中，其中一份為對(duì)照，其余在不同溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）的水浴中各加熱3 h，常溫冷卻后測(cè)定533 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并觀察其顏色變化。

1.3.5.2 光穩(wěn)定性

分別取200 mL稀釋10 倍的紫鞘、紫皮和血草花色苷提取液各3 份，分別裝于9 個(gè)碘量瓶中，分別置于陽光直射處（夏季室外晴天）、室內(nèi)自然光處、室內(nèi)避光處保存，7 d后測(cè)定其 533 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并觀察其顏色變化。

1.3.5.3 金屬離子對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

分別配制5.0×10—4mol/L 的Mg2＋、Al3＋、Zn2＋、Cu2＋、Fe2+、Fe3＋、Ca2＋溶液，吸取稀釋10 倍的紫鞘、紫皮和血草花色苷提取液各5 mL，分別加入金屬離子溶液定容至15 mL。在室內(nèi)暗處放置7 d后，測(cè)定其533 nm波長(zhǎng)處的吸光度并觀察其顏色變化。

1.3.5.4 氧化還原劑對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

各取10 份10 mL稀釋了10 倍的紫鞘、紫皮和血草花色苷提取液，其中各取一份為對(duì)照，加蒸餾水定容到25 mL，其余的分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%的VC，0.1%、0.5%、1%的H2O2和0.1%、0.5%、1%的Na2SO3，定容為25 mL，在室內(nèi)暗處放置7 d后測(cè)定其在533 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5.5 食品添加劑對(duì)花色苷穩(wěn)定性的影響

分別取54 份10 mL稀釋了10 倍的紫鞘、紫皮和血草花色苷提取液，其中9 份為對(duì)照，其余分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的蔗糖，3%、4%、5%、6%的食鹽，1%、2%、3%、4%、5%的檸檬酸）溶液15 mL，在室內(nèi)暗處放置7 d后測(cè)定其在533 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫皮石斛色素的光譜特征

圖2 紫皮石斛花色苷紫外掃描圖譜Fig.2 Absorption spectra of anthocyanins from Dendrobium devonianum

由圖2可知，紫鞘型、紫條型、血草型紫皮石斛色素最大吸收波長(zhǎng)均為533 nm。劉玉芹[12]以6 種紫色蔬菜（紫洋蔥、紫甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、紫山藥、紫薯、紫紅薯）為試材提取花色苷，光譜特征表明：這6 種紫色蔬菜在500～540 nm波長(zhǎng)處都有吸收峰；陳亮等[13]提取了野生桑葚的花色苷，光譜特征表明野生桑葚花色苷在520 nm波長(zhǎng)有吸收峰；張學(xué)寧等[14]提取了藍(lán)莓果實(shí)花色苷，光譜特征表明：藍(lán)莓花色苷在535 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。岳樺等[15]提取了衛(wèi)矛葉片的花色苷，光譜特征表明：衛(wèi)矛葉片花色苷在530 nm波長(zhǎng)處有吸收峰。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，花色苷及其色素元在可見光465～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收峰[8]。由此可以判斷紫皮石斛色素屬花色苷[16]。

2.2 紫皮石斛色素理化性質(zhì)

2.2.1 溶解性

3 種類型紫皮石斛色素濃縮液不溶于石油醚、氯仿、丙酮等非極性溶劑，易溶于水、酸、醇?？梢耘袛嘣撋貙偎苄陨?，這一現(xiàn)象符合花色苷的特征[17]。

2.2.2 顏色反應(yīng)

表1 紫皮石斛花色苷顏色反應(yīng)Table 1 Color reactions of anthocyanins from Dendrobium devonianum

紫皮石斛色素溶液在不同試劑中的顏色反應(yīng)見表1。該色素遇Na2SO3褪色，加HCl溶液恢復(fù)為紅色，這一現(xiàn)象符合花色苷的 特點(diǎn)[7]。紫皮石斛色素遇5% FeCl3呈棕褐色，是化合物中無酚羥基的特征性反應(yīng)。紫皮石斛色素遇濃氨水先變藍(lán)后褪色，是因?yàn)闈獍彼蕢A性，可改變介質(zhì)pH值，并解離出銨根離子與色素分子相結(jié)合，通過改變紫皮石斛色素的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其褪色[18]。紫皮石斛色素遇堿性的碳酸鈉，介質(zhì)pH值升高，溶液變藍(lán)，但與Na＋均不與色素分子結(jié)合，因而溶液的藍(lán)色不會(huì)褪去[18]。

3 種紫皮石斛花色苷溶液在pH 1.0～6.0，花色苷顏色均呈現(xiàn)紅色，且隨pH值的增大顏色逐漸變淡，pH 3.0均呈現(xiàn)深紅色，pH 7.0時(shí)，顏色均轉(zhuǎn)為淡紫色，紫鞘和紫皮花色苷在pH 8.0～14.0時(shí)均有絮狀沉淀，血草花色苷在pH 9.0、10.0、12.0、14.0時(shí)有絮狀沉淀。

可見，紫皮石斛色素的顏色反應(yīng)現(xiàn)象均符合花色苷的特性，可初步判斷紫皮石斛色素主要成分為花色苷。

2.2.3 紫皮石斛花色苷含量

根據(jù)pH示差法公式，計(jì)算3 種紫皮石斛花色苷的含量，紫鞘型、紫條型和血草型紫皮石斛花色苷含量分別為39.65、35.05、15.85 mg/L。孫婧超[19]用pH示差法測(cè)定藍(lán)莓酒釀過程中花色苷含量，其含量為395.43 mg/L；張采等[20]用pH示差法對(duì)自制藍(lán)莓米酒中總花色苷含量進(jìn)行測(cè)定，其含量為17.48 mg/100 mL。經(jīng)查閱相關(guān)花色苷含量測(cè)定的文獻(xiàn)并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)的花色苷含量不高，可能是因?yàn)樵谔崛∵^程中雖進(jìn)行了濃縮，但沒有冷凍干燥機(jī)，濃縮后的花色苷溶液沒有進(jìn)行冷凍干燥，溶液的中含有一定的水，所以含量偏低。

2.3 紫皮石斛色素穩(wěn)定性

2.3.1 溫度對(duì)紫皮石斛花色苷的影響

圖3 溫度對(duì)紫皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of anthocyanins from Dendrobium devonianum

由圖3可知，3 種類型的紫皮石斛花色苷溶液在20 ℃條件下，花色苷穩(wěn)定性均較好，但隨著溫度升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，顏色均逐漸加深，吸光度也隨之增大，說明花色苷可以經(jīng)過分子自聚作用使花色苷的顏色增強(qiáng)[21]。

2.3.2 光照對(duì)紫皮石斛花色苷的影響

圖4 光照對(duì)紫皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of light on the stability of anthocyanins from Dendrobium devonianum

由圖4可知，3 種類型紫皮石斛花色苷溶液在避光和室內(nèi)自然光下保存，穩(wěn)定性均較好，但在室外受陽光照射后，吸光度均下降，穩(wěn)定性較差，說明紫皮石斛花色苷的穩(wěn)定性易受光照影響，光照能加快花色苷的降解[22]，在保存花色苷溶液時(shí)，應(yīng)避光、低溫保藏。

2.3.3 金屬離子對(duì)紫皮石斛花色苷的影響

由圖5可知，金屬離子對(duì)3 種類型紫皮石斛花色苷溶液的穩(wěn)定性作用由大到小均為：Mg2＋＞Al3＋＞Ca2＋＞Fe2＋＞Cu2＋＞Zn2＋＞Fe3＋＞Pb2＋。其中Mg2＋和Al3＋對(duì)花色苷有很好的增色、穩(wěn)定作用；Ca2＋和Fe2＋對(duì)花色苷的穩(wěn)定性影響不大；Cu2＋、Zn2＋和Fe3＋使花色苷明顯褪色，并伴有沉淀，這可能是因?yàn)榛ㄉ张c金屬離子形成了絡(luò)合物[23]，因此，在生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)盡量避免與Cu2＋、Zn2＋和Fe3＋等金屬離子的接觸。

圖5 金屬離子對(duì)紫皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of metal ions on the stability of anthocyanins from Dendrobium devonianum

2.3.4 氧化還原劑對(duì)紫皮石斛花色苷的影響

圖6 氧化還原劑對(duì)紫皮石斛花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of redox agents on the stability of anthocyanins from Dendrobium devonianum

由圖6可知，3 種類型紫皮石斛花色苷溶液隨著H2O2和VC、Na2SO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，花色苷的吸光度急劇下降，顏色逐漸消退，表明紫皮石斛花色苷耐氧化、耐還原性差[24]，在使用時(shí)應(yīng)盡量避免與氧化性或還原性物質(zhì)接觸。

2.3.5 食鹽、蔗糖和檸檬酸對(duì)紫皮石斛花色苷的影響

圖7 食鹽（a）、蔗糖（b）、檸檬酸（c）對(duì)紫皮石斛花色穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of salt (a)， sugar (b) and citric acid (c) on the stability of anthocyanins from Dendrobium devonianum

由圖7可知，3 種類型紫皮石斛花色苷溶液吸光度隨食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，說明食鹽對(duì)紫皮石斛花色苷有一定的增色作用；而加入蔗糖和檸檬酸后，花色苷溶液吸光度隨蔗糖和檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而減小，說明一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖和檸檬酸有明顯的褪色作用，且隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而加強(qiáng)。

3 結(jié) 論

3 種類型紫皮石斛花色苷經(jīng)紫外-可見光譜儀掃描，圖譜分析表明在可見光區(qū)533 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，結(jié)合理化性質(zhì)分析的結(jié)論，由此可以判定紫皮石斛色素屬于花色苷類色素。用pH示差法，測(cè)得紫鞘型、紫條型和血草型紫皮石斛花色苷含量分別為39.65、35.05、15.85 mg/L。

以溫度、光照、金屬離子、氧化還原劑和食品添加劑作為影響紫皮石斛花色苷穩(wěn)定性的因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種類型紫皮石斛花色苷溶液在不同因素作用下，其影響效果均一致，溫度的改變對(duì)紫皮石斛花色苷影響較大，隨著溫度升高，顏色逐漸加深，花色苷可以經(jīng)過分子自聚作用使花色苷的顏色增強(qiáng)。光照條件影響花色苷的穩(wěn)定性，在自然光照射下，花色苷極不穩(wěn)定。Mg2＋和Al3＋對(duì)花色苷有很好的增色、穩(wěn)定作用；Cu2＋、Zn2＋和Fe3＋使花色苷明顯褪色，并伴有沉淀，這可能是因?yàn)榛ㄉ张c金屬離子形成了絡(luò)合物。隨著VC、H2O2和Na2SO3濃度的增大，花色苷顏色逐漸消退，0.5% Na2SO3就能使花色苷褪色，原因是SO2作用于花色苷類色素的苯并吡喃環(huán)的4位碳上，生成了一種無色物質(zhì)[25]。食鹽對(duì)紫皮石斛花色苷有一定的增色作用，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖和檸檬酸有明顯的褪色作用，且隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而加強(qiáng)。

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Extraction and Stability of Anthocyanins from Dendrobium devonianum Grown in Longling

YANG Xiaona1， XU Ling1，*， ZHAO Changling2， YIN Zhuoping3
(1. Resources and Environmental Sciences， Baoshan University， Baoshan 678000， China; 2. College of Agricultural and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 3. Longling Dendrobium Institute， Baoshan 678300， China)

The solvent extraction and stability of anthocyanins from the stems of Dendrobium devonianum grown in Longling， Yunnan province， China were studied. The results showed that the absorption peak of the anthocyanins occurred at 533.0 nm. Solubility and color tests showed that anthocyanins were the major components of the pigments extracted from Dendrobium devonianum. The total contents of anthocyanin in purple sheath-type， purple strip-type and red core-type Dendrobium devonianum were 39.65， 35.05 and 15.85 mg/L， respectively. The temperature to some extent had great effect on the anthocyanins of Dendrobium devonianum. As the temperature rose， the color gradually deepened. When exposed to sunlight， the anthocyanins were unstable extremely. Metal ions such as Mg2+and Al3+had hyperchromic and protective effects on the pigments， while Cu2+， Zn2+and Fe3+could result in fading of the color accompanied with apparent precipitation. Increasing concentration of H2O2， VC and Na2SO3could accelerate fading. However， Na2SO3exhibited a hyperchromic effect on the pigments， but sucrose and citric acid could exert negative effects on the stability of the anthocyanins.

Dendrobium devonianum; anthocyanin; extraction; identification; stability

TS255.1

A

1002-6630（2015）09-0049-06

10.7506/spkx1002-6630-201509010

2014-05-12

保山市第一批中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人項(xiàng)目（bszqnxshjsdtr2012-04）；保山市科技計(jì)劃項(xiàng)目；云南省應(yīng)用研究基礎(chǔ)面上項(xiàng)目（2011FB094）

楊曉娜（1984—），女，助教，碩士，研究方向?yàn)橹参锾烊簧?。E-mail：hemuzeyang@163.com

*通信作者：徐玲（1978—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)與病蟲害防治。E-mail：xuling09083@163.com