孫肖琛，王 芳，孟 楣，張 賀，陳 娟，李澤庚

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué);2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230031;3.安徽省蕪湖市中醫(yī)院，安徽蕪湖 241000)

芪白平肺膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑(專(zhuān)利號(hào):ZL2010 1 0573274.1)，由黃芪、生曬參、川芎、地龍、薤白、五味子、葶藶子等七味中藥組成。黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫、托瘡生肌之功效;生曬參具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津、安神益智之功效;川芎具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效;地龍具有清熱息風(fēng)、通絡(luò)、平喘、利尿之功效;薤白具有通陽(yáng)散結(jié)，行氣導(dǎo)滯之功效;五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效;葶藶子具有瀉肺平喘、利水消腫之功效，七味藥合用，可以補(bǔ)氣、溫陽(yáng)、化瘀。主要用于治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)，能改善COPD患者肺功能，明顯降低COPD患者的中醫(yī)證候積分，有較好療效［1－2］。

生曬參對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等有廣泛作用，人參皂苷Rb1的現(xiàn)代藥理研究表明其具有良好的抗心律失常作用，對(duì)心律失常等心血管系統(tǒng)疾病具有治療改善作用［3－4］，與本制劑的藥理藥效具有一致性，因此本試驗(yàn)以人參皂苷Rb1為指標(biāo)，控制該制劑的質(zhì)量。超高效液相色譜(UPLC)因具有流速低、節(jié)省溶劑，保留時(shí)間短，分離效率及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于化學(xué)成分復(fù)雜的中藥分析領(lǐng)域［5－8］。目前，雖有對(duì)制劑中黃芪甲苷［9］、人參皂苷Rg1、Rb［10］1和五味子醇甲［11］含量測(cè)定的報(bào)道，但未見(jiàn) UPLCELSD法測(cè)定制劑中人參皂苷Rb1含量的研究。已見(jiàn)報(bào)道的人參皂苷Rb1含量測(cè)定方法有HPLC法，HPLC-ELSD法，RP-HPLC法，UPLC法，UPLC-ELSD法，UPLC-MS-MS 法，LC-MS-MS 法等［12－17］。在前期研究的基礎(chǔ)上，為了更好地控制制劑的質(zhì)量，經(jīng)過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)［18－19］，本試驗(yàn)采用UPLC-ELSD 法測(cè)定制劑中人參皂苷Rb1含量，為芪白平肺膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ACQUITY UPLC(美國(guó)Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ELSD檢測(cè)器、Empower2色譜工作站);BP211D十萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius公司);Kudos超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 人參皂苷Rb1購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(批號(hào):110704－200921);芪白平肺膠囊由本院制劑中心提供(批號(hào):20130530、20130902、20131121);乙腈、甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher)，水為屈臣氏蒸餾水、其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Waters Acquity UPLCBEH C18色譜柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。

檢測(cè)器:Acquity ELSD檢測(cè)器;流動(dòng)相:乙腈與水不同比例的梯度洗脫，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 人參皂苷Rb1測(cè)定的梯度洗脫條件

流速:0.3 mL·min－1;柱溫:30℃;漂移管溫度:80℃;氮?dú)饧兌?99.9%;氮?dú)鈮毫?24.0 psi。在上述色譜條件下，人參皂苷Rb1可與其它成分基線(xiàn)分離，陰性無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱(chēng)取人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解并稀釋至刻度制得 0.24 g·L－1對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取三批膠囊內(nèi)容物(批號(hào):20130530、20130902、20131121)各約 1.6 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙移入100 mL錐形瓶中，加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 除去處方中生曬參藥材，其余藥材按處方比例做成陰性樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下人參皂苷 Rb1對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 Y=1.616X+6.900;r=0.998 4，表明人參皂苷Rb1在0.24～1.20μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。見(jiàn)圖2。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液2μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD為1.5% ，表明儀器精密度良好。見(jiàn)表2。

表2 人參皂苷Rb1精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品(批號(hào)20130530)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取溶液2 μL 分別于0、2、4、8、12 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積RSD為1.0%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表3。

表3 人參皂苷Rb1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取同一批號(hào)樣品(批號(hào)20130530)6 份各約1.6 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成樣品溶液，精密吸取2μL，注入超高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果表明，樣品中人參皂苷Rb1含量RSD為1.1%，重復(fù)性良好。見(jiàn)表4。

表4 人參皂苷Rb1重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的膠囊內(nèi)容物(批號(hào)20130530)9份，各約1.6g，分別加入一定量的人參皂苷Rb1對(duì)照品，加入量為樣品中人參皂苷 Rb1含量的80%，100%，120%，各配制三份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成待測(cè)溶液，精密吸取待測(cè)液溶液2μL，按上述色譜條件測(cè)定，平均加樣回收率為96.88%(RSD=1.28%)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 人參皂苷Rb1加樣回收率

2.8 樣品含量測(cè)定 取 3批樣品(批號(hào):20130530、20130902、20131121)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇 2010年版《中國(guó)藥典》一部人參項(xiàng)下［20］，人參含量測(cè)定指標(biāo)有三個(gè):人參皂苷Rg1、Re、Rb1，在本制劑試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn) Rg1、Re 位置處的色譜峰有干擾，分離度不夠好，不能作為本制劑質(zhì)量控制指標(biāo)，而人參皂苷Rb1峰形好，可以與相鄰色譜峰較好的分離，故選取人參皂苷Rb1作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 測(cè)定方法的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾嘗試采用HPLC-UV法和HPLC-ELSD法測(cè)定芪白平肺膠囊中人參皂苷 Rb1的含量。結(jié)果，HPLC-UV法末端吸收溶劑，干擾大，且紫外檢測(cè)器的靈敏度及選擇性較差。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可消除溶劑干擾，且基線(xiàn)較平穩(wěn)，有利于檢測(cè)人參皂苷Rb1色譜峰。HPLC-ELSD法分離度、重復(fù)性等較理想，但與UPLC-ELSD法相比，HPLC-ELSD法出峰時(shí)間較長(zhǎng)，溶劑用量大，分析效率低等。因此，本試驗(yàn)采用UPLCELSD法對(duì)人參皂苷Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果該法保留時(shí)間短，分析效率高，且進(jìn)樣量少，靈敏度高，溶劑損耗減少。

表6 樣品中人參皂苷Rb1含量測(cè)定

3.3 流動(dòng)相的選擇 參考2010年版《中國(guó)藥典》一部人參項(xiàng)下規(guī)定［20］，選擇乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)情況，調(diào)整乙腈與水的比例，最終確定梯度洗脫程序?yàn)?0 min 25%A，1 ～5 min 30%A，5 min 35%A，6 ～8 min 70%A，8～10 min 25%A，結(jié)果色譜峰分離度、峰形較好。

3.4 制備方法的選擇 選擇供試品溶液制備方法時(shí)，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)醇提法，無(wú)論是回流法、索氏提取法或甲醇超聲提取法，人參皂苷Rb1色譜峰分離效果均不理想，而加水超聲提取分離效果較好，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，故選擇水溶液超聲處理法。

本實(shí)驗(yàn)建立的UPLC-ELSD方法可在短時(shí)間內(nèi)快速分離檢測(cè)制劑中人參皂苷Rb1，簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，可以用于芪白平肺膠囊人參皂苷Rb1含量測(cè)定，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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