成 彥，陳 偉

(1.江蘇省南京市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇南京 210000;2.江蘇省蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

復(fù)方血栓通膠囊是由中山眼科中心與廣東眾生藥業(yè)股份有限公司聯(lián)合研制的純中藥復(fù)方制劑，處方由君藥三七、臣藥丹參、佐使藥黃芪和玄參組成，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效，臨床上常用于治療血疲兼氣陰兩虛證的視網(wǎng)膜靜脈阻塞，癥見視力下降或視覺異常，眼底疾血征象，神疲乏力，嘲干，口干等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該制劑具有擴(kuò)張血管，提高肌體抗缺氧能力，降低血液黏度，促進(jìn)血液循環(huán)，改善微循環(huán)等作用。大量研究證實(shí)，復(fù)方血栓通膠囊對(duì)于治療眼科疾病尤其是糖尿病視網(wǎng)膜病變具有顯著的療效［1－6］。2010年版《中國(guó)藥典》對(duì)該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂［7］，采用HPLC法測(cè)定人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1的總量作為其含量測(cè)定控制項(xiàng)，隨著藥學(xué)研究的不斷深入，對(duì)中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制要求越來越高，舊的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)不斷的提高。該藥所用的君藥三七，其總皂苷組成并非只有人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1這三種皂苷，故筆者參考另一制劑血栓通注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，擬建立HPLC法同時(shí)測(cè)定5種皂苷類成分，以期更準(zhǔn)確地反映復(fù)方血栓通膠囊的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters2695液相色譜儀(Waters 2489紫外檢測(cè)器，EmpowerⅡ色譜工作站);Mettler Toledo XS105DU十萬分之一電子天平;KQ－400GKDV超聲波清洗機(jī)。

1.2 試藥 三七皂苷R1(批號(hào):201318)、人參皂苷Rg1(批號(hào):201128)、人參皂苷 Re(批號(hào):200822)、人參皂苷Rb1(批號(hào):201223)、人參皂苷Rd(批號(hào):201001)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。復(fù)方血栓通膠囊(廣東眾生藥業(yè)股份有限公司10個(gè)批次產(chǎn)品，批號(hào)為120523、121022、121134、121221、130213、130421、130512、130622、130714、130813)。甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merk公司)，試驗(yàn)用水為超純水(美國(guó)Millipore公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:YMC－Pack Pro C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);以乙腈為流動(dòng)相 A，水為流動(dòng)相B，按表1梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;柱溫為 35 ℃;流速為1.0 mL·min－1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取三七總皂苷對(duì)照提取物12.55 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每毫升含三七皂苷 R10.501 0 mg、人參皂苷 Rg11.510 2mg、人參皂苷 Re 0.320 1 mg、人參皂苷 Rb11.022 3mg、人參皂苷 Rd 0.163 2 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 取供試品，研細(xì)，混勻，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 以溶劑甲醇為空白，按照“2.1”的色譜條件，進(jìn)樣10μL。

2.2.4 測(cè)定法 精密吸取上述溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。三七皂苷R1對(duì)照品峰的理論板數(shù)為15 139，主峰和雜質(zhì)峰分離良好，分離度為11.1，拖尾因子1.01，色譜圖見圖1 ～3。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 線性關(guān)系考查 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1、2、4、8、10 μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，五種對(duì)照品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)范圍見表2。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)范圍

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得對(duì)照品溶液峰面積，5種組分峰面積積分值的 RSD 分別為0.05%，0.03%，0.11%，0.69%，0.07%。表明儀器精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h 各取10 μL 進(jìn)樣，測(cè)定對(duì)照品溶液中5個(gè)對(duì)照品峰面積，計(jì)算RSD，以此來測(cè)定5種皂苷在室溫條件下的穩(wěn)定性，其測(cè)得對(duì)照品的峰面積值積分的 RSD 分別為 0.07%，0.10%，0.12%，0.07%，0.21%。表明對(duì)照品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批復(fù)方血栓通膠囊樣品(批號(hào):120523)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件，分別測(cè)定5個(gè)皂苷峰面積，其 RSD 分別為 1.01%，0.98%，0.79%，1.03%，1.15%。表明該方法重復(fù)性好。

2.3.5 定量限試驗(yàn) 將上述對(duì)照品溶液分別稀釋后進(jìn)樣，根據(jù)峰高以信噪比S/N=10確定定量限。三七皂苷 R1為5.43 ng、人參皂苷 Rg1為 4.34 ng、人參皂苷 Re為3.44 ng、人參皂苷 Rb1為 3.56 ng、人參皂苷Rd為5.78 ng。

2.3.6 檢測(cè)限試驗(yàn) 同定量限測(cè)定方法，根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢測(cè)限。三七皂苷R1為1.81 ng、人參皂苷 Rg1為 1.45 ng、人參皂苷 Re 為1.15 ng、人參皂苷 Rb1為 1.19 ng、人參皂苷 Rd 為1.93 ng。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的樣品(取重復(fù)性項(xiàng)下的復(fù)方血栓通膠囊樣品，批號(hào):120523，每粒含三七皂苷R11.71 mg，人參皂苷Rg110.42 mg、Re 為0.40 mg、Rb15.23 mg、Rd 0.67 mg)6份，每份0.25 g，置具塞錐形瓶中，精密加入一定量的5種皂苷類對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，精密吸取上述溶液各10μL進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3～7。

表3 三七皂苷R1加樣回收率

表4 人參皂苷Rg1加樣回收率

表5 人參皂苷Re加樣回收率

表6 人參皂苷Rb1加樣回收率

表7 人參皂苷Rd加樣回收率

2.3.8 樣品測(cè)定 測(cè)定10批復(fù)方血栓通膠囊中5種皂苷類成分含量，結(jié)果顯示，10批樣品三七總皂苷含量波動(dòng)較小，且都符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的每粒含三七總皂苷為9.0 mg，表明該制劑的原料選擇較為嚴(yán)格，工藝較為穩(wěn)定(見表8)。

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果/mg·粒－1

3 討論

復(fù)方血栓通膠囊臨床上廣泛應(yīng)用于血瘀兼氣陰兩虛證所致的視網(wǎng)膜靜脈阻塞的治療，其中三七皂苷類化合物是活血化瘀藥發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)復(fù)方血栓通膠囊中君藥三七主要成分進(jìn)行含量測(cè)定方法的探究，在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd兩個(gè)成分的含量測(cè)定，使得三七總皂苷的成分監(jiān)測(cè)組達(dá)到5個(gè)，更為全面地反映了主成分含量。并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制［8］。

此外，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明丹參的水溶性類成分為其活血化瘀的有效成分［9］，復(fù)方血栓通膠囊中臣藥丹參，也應(yīng)當(dāng)是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的重點(diǎn)。后續(xù)研究可增加丹參中有效成分丹參素、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ、隱丹參酮等的含量測(cè)定［10］。黃芪中的黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，玄參的中哈巴俄苷也可作為標(biāo)準(zhǔn)提升點(diǎn)［11］。可借鑒“一測(cè)多評(píng)”的理念［12－14］，通過一個(gè)對(duì)照品的檢測(cè)，來實(shí)現(xiàn)該成方制劑的多組分同步測(cè)定，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，是適合中藥特點(diǎn)多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)的新方法，為更全面評(píng)價(jià)復(fù)方血栓通膠囊的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

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